1)细菌总数的测定
将一定量水样(原水样或做一定稀释后的水样)接种在普通营养琼脂培养基内,在37 ℃培养24 小时后,计数培养基上的细菌菌落数,然后换算出原水样每毫升中所含的细菌数。
37 ℃时,在营养琼脂培养基中能生长的细菌,代表在人体温度下能繁殖异养型细菌。 因此,在生活饮用水中所测得的细菌总数,除说明水被生活废弃物污染的程度外,还可指示该水能否饮用。 我国《生活饮用水标准检验方法》(GB 5750—2006)规定,细菌总数不得超过100个/mL。 一般认为,含细菌10 ~100 个/mL 的水体为极清洁;含细菌100 ~1 000 个/mL 的水体为清洁;含细菌1 000 ~10 000 个/mL 的水体为不太清洁;含细菌10 000 ~100 000 个/mL 的水体为不清洁;含细菌多于100 000 个/mL 的水体为极不清洁。
水中细菌总数的测定,对于检查水厂中各个处理设备的处理效率具有一定实用意义。 如果设备的运转稍有失误,立刻就会影响水中细菌的数量。
2)大肠菌群的测定
大肠菌群的检验方法有发酵法和滤膜法。
(1) 发酵法
发酵法是测定大肠菌群的基本方法,包括初发酵试验,平板分离和复发酵试验3 个部分。
①初发酵试验。 将水样置于乳糖蛋白胨液体培养基内,加入溴甲酚紫pH 指示剂,若细菌产酸,培养基由紫色变为黄色。 在乳糖蛋白胨液体培养基发酵试管中,倒置小导管,若细菌产气,小导管内就会有气泡。 若水样接种于发酵管内,37 ℃下培养24 小时,产酸产气,则为阳性结果,说明水中存在大肠菌群;若既不产酸也不产气,则为阴性结果,说明水中不存在大肠菌群;若只产酸不产气,不能说明是阴性结果,应视为可疑结果。 对阳性管和可疑管,需继续做平板分离。
除大肠菌群外,水中能使糖类发酵的细菌最常见的有厌氧和好氧的芽孢杆菌。 在被粪便严重污染的水中,这类细菌的数量比大肠菌群的数量要少得多。 在此情形下,本阶段的发酵一般可被认为确有大肠菌群存在。 在比较清洁的或加氯的水中,由于芽孢的抵抗力比较强,其数量可能相对较多,所以本试验即使产酸产气,也不能肯定是由大肠菌群引起,必须继续进行试验。
②平板分离。 这一阶段的检验主要是根据大肠菌群在固体培养基上可以在空气中生长、革兰氏染色呈阴性和不生芽孢的特性来进行的。 这一阶段的培养基一般使用远藤氏培养基或伊红亚甲蓝脂培养基。 远藤氏培养基以碱性品红染料作为指示剂,它可被培养基中的亚硫酸钠脱色,使培养基呈淡粉红色,而大肠菌群发酵乳糖产生的酸和乙醛,可与品红反应,形成深红色复合物,使大肠菌群菌落表现为带金属光泽的深红色,亚硫酸钠还可抑制其他杂菌的生长。伊红亚甲蓝琼脂培养基以伊红与亚甲蓝染料作为指示剂,大肠菌群发酵乳糖造成酸性环境时,该两种染料即结合成复合物,使大肠菌群产生与远藤氏培养基上相似的、带核心的、有金属光泽的深紫色菌落。
为了做进一步的肯定,应进行革兰氏染色检验。 由于芽孢杆菌经革兰氏染色后一般呈阳性,所以根据染色结果,又可将大肠菌群与好氧芽孢杆菌区别开来。 如果革兰氏染色检验发现有阴性无芽孢杆菌存在,则可做复发酵试验来进一步检验。
③复发酵试验。 将革兰氏染色阴性、无芽孢杆菌的菌落,再接种于乳糖蛋白胨液体培养基中,在37 ℃培养24 小时,产酸产气,确定为大肠菌群阳性结果。
对于自来水厂出水,初步发酵试验一般都在10 个小发酵管和2 个大发酵管(或发酵瓶)内进行,复发酵试验则在小发酵管内进行。
根据初发酵管数、初发酵阳性管数及检测水样量,可利用托马斯公式计算出每升水样中大肠菌群的最大近似数(most probable number,MPN)。
(2)滤膜法
用发酵法完成全部检验需72 小时。 为了缩短检验时间,可以采用滤膜法。 用这种方法检验大肠菌群,有可能在30 小时左右完成。 滤膜法中用的滤膜常是一种多孔性硝酸纤维薄膜。圆形滤膜直径一般为35 mm,厚0.1 mm。 滤膜中小孔的直径平均为0.2 μm。
滤膜法的主要步骤如下:
①将滤膜装在滤器上。 用抽滤法过滤定量水样,将细菌截留在滤膜表面。
②将此滤膜没有细菌的一面贴在品红亚硫酸钠培养基或伊红亚甲蓝固体培养基上,以培育和获得单个菌落。(www.xing528.com)
③将滤膜上符合大肠菌群菌落特征的菌落进行革兰氏染色、镜检。
④将革兰氏染色阴性无芽孢杆菌的菌落,接种到含糖培养基中,根据产气与否来判断有无大肠菌群存在。
⑤根据滤膜上生长的大肠菌群菌落数和过滤水样体积,即可算出每升水样中的大肠菌群数。 滤膜法比发酵法的检验时间短,但仍不能及时指导生产。 当发现水质有问题时,这种不符合标准的水已进入管网一段时间了。 此外,当水样中悬浮物较多时,悬浮物会沉积在滤膜上,影响细菌的发育,使测定结果不准确。
为了保证给水水质符合卫生标准,有必要研究快速而准确的大肠菌群检验方法。 国外曾有人研究用示踪原子法,例如用放射性同位素14C 的乳糖作培养基,可在1 小时内初步确定水中有无大肠杆菌。 国外大型水厂还有电子显微镜直接观察大肠杆菌的。
目前以大肠菌群作为检验指标,只间接反映生活饮用水被肠道病原菌污染的情况,而不能反映水中是否有传染性病毒以及除肠道病原菌外的其他病原菌(如炭疽杆菌)。 因此,为了保证人民的健康,必须加强水中病原微生物检验的研究工作。
3)粪大肠菌群的测定
(1)初发酵试验
同总大肠菌群。
(2)复发酵试验
轻摇初发酵试验呈阳性的发酵管,用内径为3 mm 的接种环以无菌操作技术取一环培养物,转接到EC 培养液发酵管内,置44.5 ℃水浴培养24 小时,产气者为阳性。
(3)计算方法
同大肠菌群。
4)噬菌体的测定
双层琼脂平板法是测定噬菌体常用的方法。 一定量经系列稀释的试样与高浓度的宿主菌悬液以及半固体营养琼脂均匀混合后,涂布在已经铺好高浓度营养琼脂的平板上,培养一段时间后,在延伸成片的菌苔上出现噬菌斑。 噬菌斑的数量与试样中具有感染性的噬菌体数成正比,由此可计算出样品中的噬菌体数量,以噬菌斑形成单位(plaque forming unit,PFU)表示。
双层琼脂平板法最重要的因素是选择合适的宿主菌。 野生型的大肠杆菌不适于作为水中噬菌体的宿主。
目前已经制定出噬菌体检测和计数的标准方法(ISO 10705),具体步骤请参见相关材料。
在进行噬菌体的检测时,培养基成分是一个很重要的因素。 据报道,噬菌体分析琼脂、改良Scholtens 琼脂、改良营养琼脂能够产生较多的噬菌斑,这可能与它们都含有二价阳离子(Ca2+、Mg2+、Sr2+)有关,采用大的培养平板并铺入薄的培养基,也会使噬菌斑数增加。 严格厌氧条件下,在培养基和分析介质中加入0.25%的胆汁,能使检测出的噬菌体数量提高1 倍以上。
目前,噬菌体和病毒的保存方法还不统一,其中对大肠杆菌噬菌体MS2 的保存和标准物制备的报道较多。 通过硝酸纤维滤膜、吸附、沉淀、用10%甘油保存的自然样品中的土著噬菌体,在-70 ℃和-20 ℃条件下可稳定保存2 个月,在黑暗中[(5 ±3) ℃]可保存72 小时。
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