微生物生长测定：应用微生物学原理与技术的成果

微生物的生长依据的是群体的增加量，因此测定微生物群体的生长量来表征微生物的生长。 微生物生长量的测定方法很多，可以根据菌体细胞数量、菌体体积或质量直接测定，也可以用某种细胞物质的含量或某个代谢活性的强度间接测定。

1)细胞数的测定

此法通常用来测定样品中所含细菌、孢子、酵母菌等单细胞微生物的数量，计数通常分为直接计数和间接计数。

（1）直接计数法

该方法使用细菌计数器或血细胞计数板（适用于酵母菌、真菌孢子等），在显微镜下计算一定容积样品中微生物的数量。 计数板是一块特制的载玻片，上面有一个特定的面积为1 mm2、高为0.1 mm 的计数室，计数室的正面刻划成25（或16）个中格，每个中格进一步划分为16（或25）个小格，每个计数室均由400 个小格组成，如图2.1 所示。

图2.1　血细胞计数板

清洗计数板及盖玻片，用擦镜纸擦拭干净，将盖玻片放在计数板上，用无菌吸管吸取一定稀释度的样品悬液沿凹槽滴加1 滴，让菌悬液沿计数板与盖玻片间的缝隙充满计数室，在显微镜下随机数5 个中格的菌体数目，并求出每个小格所含菌体的平均数，再按以下公式计算1 mL 样品所含的同菌体数。

原液所含菌体数（个/mL） =每小格平均菌体数×400 ×104 ×稀释倍数

该方法的优点是快捷简便、容易操作、成本低，且能观察细胞的大小与形态；其缺点是不适于运动细菌的计数。 菌悬液浓度一般不宜过低或过高，个体小的细菌在显微镜下难以观察。 它不能区分死菌与活菌，因此测定得到的菌体数是包括死细胞在内的总菌数。 针对不能测定活细胞数的缺点，已通过用特殊染料对活菌进行染色后再用显微镜计数的方法来解决。 如采用亚甲蓝液对酵母菌染色后，其活菌为无色，而死细胞为蓝色，则可分别计数。 又如，细菌经吖啶橙染色，在紫外光显微镜下可观察到活细胞发出橙色荧光，而死细胞则发出绿色荧光，也可作活菌和总菌计数。

形体较大的微生物还可用电子计数器（如Coulter计数器）进行直接计数。 其原理是，在一个小孔两侧放置电极并通电，电极可以测量电阻变化，当细胞悬液通过该小孔时，每通过一个细胞，电阻就会增加（或导电性下降），产生一个电信号，计数器对该细胞自动计数一次。 但是，该方法容易受样品中微小颗粒及丝状物的干扰而不适合细菌数量的测定。

（2）间接计数法

间接计数法包括液体稀释法、平板菌落计数法、滤膜过滤培养法、比浊法和厌氧菌的菌落计数法5 种。

①液体稀释法。 该法主要适用于只能进行液体培养的微生物，或采用液体鉴别培养基进行直接鉴定并计数的微生物。 将待测样品做一系列稀释，一直稀释到取少量该稀释液（如1 mL）接种到新鲜培养基中没有或极少出现生长繁殖为止。 之后通过3 ～5 次重复的临界级数求最大概率数（the most probable number，MPN）得到结果。(www.xing528.com)

本法用于测定在一个混杂的微生物群中不占优势，但却具有特殊生理功能的类群。 其特点是利用待测微生物的特殊生理功能来摆脱其他微生物类群的干扰，并通过该生理功能的表现来判断该群微生物的存在及丰度。 本法特别适合于测定土壤微生物中特定生理群（如氨化，硝化、纤维素分解、自生固氮、根瘤菌、硫化和反硫化细菌等）的数量和检测污水、牛奶及其他食品中特殊微生物类群（如大肠菌群）的数量。 其缺点是只能进行特殊生理群的测定。

②平板菌落计数法。 取一定的菌悬液，采用涂布平板法或倾注法让微生物单细胞分散在平板上（内），在适宜的条件下培养，每一个活细胞就形成一个单菌落，根据每个培养皿上形成的菌落数乘以稀释倍数，可推算出样品的含菌数。

平板计数法简单、灵敏，广泛应用于食品、水体、土壤及其他材料中所含细菌、酵母菌、芽孢与孢子等数量的测定，但不适于测定样品中丝状体微生物的数量。 在操作过程中，样品稀释度最好应控制在每个平板上菌落数为30 ～300 个，过多难以计数，过少则增大计数误差。

③滤膜过滤培养法。 当样品中菌数很少时，如海水、湖水或饮用水等样品，可采用滤膜过滤培养法进行直接计数或间接计数。 具体方法是，取一定体积的样品溶液通过过滤器，然后将滤膜干燥、染色，再经显微镜进行直接计数，但该方法计数结果中含有死菌。 要得到活菌数量，可将样品滤过的滤膜置于培养基上或有液体培养基浸润的垫状物上培养，通过在滤膜上形成的菌落数获得样品中的活菌数。 如用特殊培养基，可在滤膜上得到需要选择的微生物菌落，这种技术在水样分析中得到了极大应用。

④比浊法。 这是测定悬液中细胞数的快速方法。 其原理是菌体不透光，光束透过菌悬液时可引起光的散射或吸收，降低透光率。 在一定的浓度范围内，菌悬液的微生物细胞浓度与液体的光密度成正比，与透光度成反比。 菌数越多，透光量越低。 因此，可使用分光光度计，在可见光450 ～650 nm 波段内测定，通过测定菌悬液的光密度或透光率反映细胞的浓度。 由于细胞浓度仅在一定范围内与光密度呈直线关系，因此待测菌悬液的细胞浓度不应过低或过高，培养液的颜色也不宜过深，颗粒性杂质的数量应尽量减少。 本法常用于观察和控制培养过程中微生物菌数的消长情况。 如细菌生长曲线的测定和发酵罐中细菌生长量的控制等。

⑤厌氧菌的菌落计数法。 用厌氧培养技术进行测定，一般采用亨盖特（Hungate）滚管培养法进行。 但此法设备复杂，技术难度高。

2)细胞生物量的测定

（1）细胞干重法

将单位体积的微生物培养液经离心或过滤（丝状真菌用滤纸过滤，细菌用醋酸纤维膜等进行过滤）后收集，并用清水反复洗涤菌体，直接称重，可得菌体湿重。 再经常压或真空干燥，干燥温度常采用50 ～100 ℃烘干至恒重，然后精确称重，即可计算出微生物的干重。 在琼脂平板培养基上培养的放线菌或丝状真菌，可先加热至50 ℃，待琼脂熔化后滤出菌丝，用50 ℃的生理盐水洗涤菌丝后测定湿重和干重。

（2）总氮量测定法

蛋白质是生物体细胞的主要成分，含氮15% ～18%核酸及类脂等也含有一定量的氮素。已知细菌细胞干重的含氮量一般为12% ～15%，酵母菌为7.5%，霉菌为6.5%。 因此，只要用化学分析方法（如凯氏定氮法）测出待测样品的含氮量，就能推算出细胞的生物量。 本法适用于在固体或液体条件下测定微生物的总生物量，但需充分洗涤菌体以除去含氮杂质。 其缺点是操作程序较复杂，一般很少采用。

上述每种方法都各有优点和局限性。 只有在综合考虑这些因素同需要解决的问题之间的关系后，才能选择具体的方法。 正如前面所说，平板菌落计数是微生物学中应用最多的常规方法，掌握这一方法的原理和实际操作很有必要。 此法在理论上能反映活菌数。 另外，当用两种不同的方法测量细菌的生长量时，其结果不一致是完全可能的。 测定微生物的生长量，在理论和实践上都十分重要。 要对细菌在不同培养基中或不同条件下的生长情况进行评价或解释时，就必须用数量来反映它的生长。 例如，可以通过细菌生长的快慢来判断某一条件是否适合。