微生物培养基的应用技术

培养基是人工配制的、适合微生物生长繁殖或产生代谢产物的营养基质。

1)配制培养基的原则

（1）选择适宜的营养物质

不同微生物对营养物质的需求是不一样的，因此首先要根据不同微生物的营养需求配制针对性强的培养基。 培养自养型微生物的培养基完全可以（或应该）由简单的无机物组成。例如，培养化能自养型的氧化硫杆菌不必在培养基中加入其他碳源物质，仅依靠空气中和溶于水中的CO2 为氧化硫杆菌提供碳源；培养异养型微生物需要在培养基中添加有机物，而且不同类型异养型微生物的营养要求差别很大，例如常用牛肉膏蛋白胨培养基（或简称普通肉汤培养基）培养细菌，用高氏1 号合成培养基培养放线菌，用麦芽汁培养基培养酵母菌，用查氏培养基培养霉菌。

（2）营养物质浓度及配比合适

培养基中营养物质浓度合适时，微生物才能生长良好；营养物质浓度过低不能满足微生物正常生长所需；浓度过高时则可能对微生物生长起抑制作用，例如高浓度糖类物质、无机盐、重金属离子等不仅不能维持和促进微生物的生长，反而起到抑制或杀菌作用。 培养基中各营养物质之间的浓度配比直接影响微生物的生长繁殖和代谢产物的形成积累，其中对碳氮比的影响较大:碳源不足，菌体易早衰；氮源不足，菌体生长过慢；氮源过量，菌体生长过旺，代谢产物积累少。 因此，可调控培养基中碳氮比来控制菌体生长与代谢产物合成的协调。

（3）控制适宜的理化条件

①培养基pH 值的控制。 培养基的pH 值必须控制在一定的范围内，以满足不同类型微生物的生长繁殖或代谢产物产生。 一般来讲，细菌与放线菌适于在pH 7.0 ～7.5 范围内生长，由于营养物质被分解利用和代谢产物的形成与积累，会导致培养基pH 值发生变化，若不对培养基pH 值进行控制，往往导致微生物生长速度和代谢产物产量降低。 因此，为了维持培养基pH 值的相对恒定，通常在培养基中加入pH 缓冲剂，常用的缓冲剂是磷酸盐如K2HPO4 和KH2PO4 组成的混合物，但K2HPO4/KH2PO4 缓冲系统只能在一定的pH 值范围（6.4 ～7.2）内起调节作用。 有些微生物，如乳酸菌能大量产酸，上述缓冲系统就难以起到缓冲作用，此时可在培养基中添加难溶的碳酸盐（如CaCO3）进行调节。 CaCO3 难溶于水，不会使培养基pH 值过度升高，但它可以不断中和微生物产生的酸，同时释放出CO2，将培养基pH 值控制在一定范围。 在培养基中还存在一些天然的缓冲系统，如氨基酸、肽、蛋白质，都属于两性电解质，也可起到缓冲剂的作用。

②渗透压的控制。 绝大多数微生物适宜在等渗溶液中生长，一般培养基的渗透压都是适合的，但培养嗜盐微生物（如嗜盐细菌）和嗜渗压微生物（如高渗酵母）时就要提高培养基的渗透压。 培养嗜盐微生物常加适量NaCl，海洋微生物的最适生长盐度约为3.5%。 培养嗜渗压微生物要加接近饱和量的蔗糖。

（4）原料来源的选择

配制培养基时应充分考虑经济节约，尽量利用廉价且易于获得的原料作为培养基成分，特别是在大规模的发酵工业中，利用低成本的原料更能体现经济价值。 大量的农副产品，如麸皮、米糠、玉米浆、酵母浸膏、酒糟、豆饼、花生饼、蛋白胨等都是常用的发酵工业原料。 在微生物单细胞蛋白的工业生产过程中，常利用糖蜜（制糖工业中含有蔗糖的废液）、乳清（乳制品工业中含有乳糖的废液）、豆制品工业废液及黑废液（造纸工业中含有戊糖和己糖的亚硫酸纸浆）等作为培养基的原料。

（5）灭菌处理

微生物培养过程中必须避免杂菌污染，因此应对所用器材、工作场所、培养基等进行消毒与灭菌，常采用高压蒸汽灭菌，一般培养基的灭菌条件是1. 05 kg/cm2、121 ℃维持15 ～30 min。在高压蒸汽灭菌过程中，长时间高温会使某些不耐热物质遭到破坏，如使糖类物质形成氨基糖、焦糖，因此含糖培养基常用0.56 kg/cm2、112 ℃维持15 ～30 min 进行灭菌。 某些对糖要求较高的培养基，可先将糖进行过滤除菌或间歇灭菌，再与其他已灭菌的成分混合；长时间高温还会引起磷酸盐、碳酸盐与某些阳离子（特别是钙、镁、铁离子）结合，形成难溶性复合物而产生沉淀。 因此，在配制用于观察和定量测定微生物生长状况的合成培养基时，常在培养基中加入少量螯合剂，避免培养基中产生沉淀而影响溶解氧（dissolved oxygen，DO）值的测定，常用的螯合剂为EDTA。 还可以将含钙、镁、铁等离子的成分与磷酸盐、碳酸盐分别进行灭菌，然后再混合，避免形成沉淀；高压蒸汽灭菌后，培养基pH 值会发生改变（一般使pH 值降低），可根据所培养微生物的要求，在培养基灭菌前后加以调整。 泡沫的存在对灭菌处理极为不利，因为泡沫中的空气形成隔热层，使泡沫中微生物难以被杀死。 因而有时需要在培养基中加入消泡剂以减少泡沫的产生，或适当提高灭菌温度，延长灭菌时间。

2)培养基的类型及应用

培养基的种类繁多，名形各异，通常可以根据其成分、物理状态和用途进行类型划分。

（1）按成分不同划分

根据培养基中物质的化学成分类别或含量的不同，一般可分为天然培养基、合成培养基和半合成培养基3 种类型。

①天然培养基。 这类培养基含有化学成分还不清楚或化学成分不恒定的天然有机物。 牛肉膏蛋白胨培养基和麦芽汁培养基就属于此类。 常用的天然有机营养物质包括牛肉膏、蛋白胨、酵母浸膏、豆芽汁、玉米粉、牛奶等。 天然复合培养基成本较低，除在实验室经常使用外，也适宜用来进行工业大规模的微生物发酵生产。 基因克隆技术中常用的LB 培养基也是一种天然复合培养基。

②合成培养基。 合成培养基是由完全已知化学成分的物质配制而成，也称化学限定培养基。 高氏1 号培养基和查氏培养基就属于此种类型。 配制合成培养基时重复性强，但与天然培养基相比其成本较高。 微生物在其中生长速度较慢，一般适用于在实验室进行有关微生物营养需求、代谢、分类鉴定、生物量测定、菌种选育及遗传分析等方面的研究工作。(www.xing528.com)

③半合成培养基。 半合成培养基是指一类主要用已知化学成分的化学试剂配制，同时还添加有某些天然成分的培养基，例如用于真菌培养的马铃薯蔗糖培养基。 这种培养基配置方便，常用于生产和实验研究。

（2）根据物理状态划分

根据培养基中凝固剂的有无及含量的多少，可将培养基划分为固体培养基、半固体培养基和液体培养基3 种类型。

①固体培养基。 在液体培养基中加入一定量凝固剂即为固体培养基。 理想的凝固剂应不被所培养的微生物分解利用、凝固点温度不能太低、对所培养的微生物无毒害作用、透明度好，黏着力强、配制方便且价格低廉。 常用的凝固剂有琼脂、明胶和硅胶，其中琼脂是最常用的凝固剂，硅胶适合配制、分离与培养自养型微生物的培养基。

除在液体培养基中加入凝固剂制备的固体培养基外，一些由天然固体基质制成的培养基也属于固体培养基，如马铃薯块、胡萝卜条、米糠等制成的固体状态培养基就属于此类。 生产酒的酒曲、生产食用菌的棉子壳培养基也属于固体培养基。

在实验室中，固体培养基一般加入平皿或试管中，制成培养微生物的平板或斜面。 固体培养基为微生物提供一个营养表面，单个微生物细胞在这个营养表面进行生长繁殖，可以形成单个菌落。 固体培养基常用来进行微生物的分离、鉴定、活菌计数及菌种保藏。

②半固体培养基。 半固体培养基中凝固剂的含量比固体培养基少，培养基中琼脂含量一般为0.2% ～0.7%。 半固体培养基常用来观察微生物的运动特征、分类鉴定及噬菌体效价滴定等。

③液体培养基。 液体培养基中未加任何凝固剂。 在用液体培养基培养微生物时，通过振荡或搅拌可以增加培养基的通气量，同时使营养物质分布均匀。 液体培养基常用于大规模工业生产以及在实验室进行微生物的基础理论和应用研究。

（3）按用途划分

根据培养基的用途不同，可以将其分为基础培养基、加富培养基、选择培养基和鉴别培养基4 种类型。

①基础培养基。 尽管不同微生物的营养需求各不相同，但大多数微生物所需的基本营养物质是相同的。 基础培养基含有一般微生物生长繁殖所需的基本营养物质。 牛肉膏蛋白胨培养基是最常用的基础培养基。 基础培养基也可以作为一些特殊培养基的基础成分，再根据某种微生物的特殊营养需求，在其中加入所需营养物质。

②加富培养基。 加富培养基也称营养培养基，是通过在基础培养基中加入血液，血清，酵母浸膏，动、植物组织液等特殊营养物质制成的一类营养丰富的培养基。 加富培养基一般用来培养营养要求比较苛刻的异养型微生物，也可用来富集和分离某种微生物，这是因为加富培养基含有某种微生物所需的特殊营养物质，使该种微生物在这种培养基中较其他微生物生长速度快，并逐渐富集从而达到分离该种微生物的目的。 从某种意义上讲，加富培养基类似选择培养基。

③选择培养基。 选择培养基是用来将某种或某类微生物从混杂的微生物群体中分离出来。 根据不同种类微生物的特殊营养需求或对某种化学物质的敏感性不同，在培养基中加入相应的特殊营养物质或化学物质，抑制其他微生物生长，促进目标微生物的生长。

选择培养基是依据某些微生物的特殊营养需求设计的，例如，利用以纤维素或石蜡油作为唯一碳源的选择培养基，可以从混杂的微生物群体中分离出能分解纤维素或石蜡油的微生物；缺乏氮源的选择培养基可用来分离固氮微生物。 另一类选择培养基是在培养基中加入某种化学物质，这种化学物质没有营养作用，对所需分离的微生物无害，但可以抑制或杀死其他微生物。 例如，在培养基中加入数滴10%酚可以抑制细菌和霉菌的生长，从混杂的微生物群体中分离出放线菌；在培养基中加入亚硫酸铋，可以抑制革兰氏阳性菌和绝大多数革兰氏阴性菌的生长，而革兰氏阴性的伤寒沙门菌（Salmonella typhi）可以在这种培养基上生长；在培养基中加入染料亮绿或结晶紫，可以抑制革兰氏阳性菌生长，达到分离革兰氏阴性菌的目的；在培养基中加入青霉素、四环素或链霉素，可以抑制细菌和放线菌生长，将酵母菌和霉菌分离出来。 现代基因克隆技术中也常用选择培养基，在筛选含有重组质粒的基因工程菌株过程中，利用质粒上具有的对某种（些）抗生素的抗性选择标记，在培养基中加入相应抗生素，就能比较方便地淘汰非重组菌株，以减少筛选目标菌株的工作量。

④鉴别培养基。 鉴别培养基是用于鉴别不同类型微生物的培养基。 在培养基中加入某种特殊化学物质，与目标微生物产生的某种代谢产物发生特定的化学反应，产生明显的特征性变化。 根据这种特征性变化，可将该种微生物与其他微生物区分开来，对微生物进行快速分类鉴定，以及分离和筛选产生某种代谢产物的微生物菌种。 常用的鉴别培养基见表2.2。

表2.2　常用的鉴别培养基

在实际应用中，有时需要配制既有选择作用又有鉴别作用的培养基。 例如，当要分离金黄色葡萄球菌时，在培养基中加入7.5%NaCl、甘露糖醇和酸碱指示剂，金黄色葡萄球菌可耐高浓度NaCl，且能利用甘露糖醇产酸。 因此，能在上述培养基生长，而且菌落周围培养基颜色发生变化，则该菌落有可能是金黄色葡萄球菌。 又如EMB 培养基中的伊红和亚甲蓝两种苯胺染料可抑制革兰阳性菌和一些难培养的革兰阴性菌。 在低酸度下，这两种染料会结合并形成沉淀，起着产酸指示剂的作用。 因此，试样中多种肠道细菌会在EMB 培养基平板上产生易于用肉眼识别的多种特征性菌落，尤其是大肠埃希菌（Escherichia coli，E. coli），因其能强烈分解培养基中的乳糖产生大量混合酸，菌体表面带H +，故可染上酸性染料伊红，又因伊红与亚甲蓝结合，使菌体染上深紫色，且从菌体表面的反射光中还可看到绿色金属闪光，其他几种产酸力弱的肠道菌的菌落也有相应的棕色；如肠杆菌属、沙雷菌属、克雷伯菌属、哈夫尼菌属等，而不发酵乳糖不产酸的肠道菌的菌落是无色透明的，如变形菌属、沙门菌属、志贺菌属等。