微生物细胞的固定化技术实验成果

一、实验目的

（1）了解微生物细胞固定化的基本原理。

（2）掌握微生物细胞的固定化操作技术。

二、实验原理

生物固定化技术是现代生物工程领域中一项新兴技术，能使生物催化剂（酶、微生物细胞、动植物细胞、细胞器等）得到更广泛、更有效的应用。目前经常采用的生物催化剂固定化方法主要有载体结合法、交联法、包埋法和逆胶束酶反应系统。

微生物细胞的固定化方法，以包埋法最常用。包埋法是将微生物包裹在凝胶微小格子（格子型）中或将微生物包裹于半透性的聚合物膜（微胶囊型）内的固定方法。其特点是能将固定化微生物制成各种形状（球形、块形、圆柱形、膜状、布状、管状等），并且固定化后的微生物能繁殖，应用最广。

常用的固定化载体包括各种无机吸附材料和有机高分子材料。有机高分子材料可分为天然高分子多糖和合成高分子化合物：天然高分子多糖如琼脂、卡拉胶、海藻酸钠等，合成高分子化台物如聚乙烯醇、聚丙烯酞胺、光敏树脂等。

图3-5　简单滴露法固定化装置

从海藻中提取获得的藻酸盐（常为钠盐）与阳离子（如钙离子、铝离子）可诱导凝胶形成，作为微生物细胞包埋的载体。微生物细胞包埋于藻酸钙凝胶中的方法主要有两种类型，即外交凝法和内交凝法，前者应用较广。外交凝法是将微生物细胞与藻酸钠溶液混和后，通过一注射器针头或相似的滴注器将上述混合液滴入氯化钙溶液中，钙离子从外部扩散入藻酸钠-细胞混合液珠内，使藻酸钠转变成不溶的藻酸钙凝胶，由此将细胞包埋其中。用于外交凝法制备藻酸钙凝胶装置有简单滴露法固定化装置（图3-5），也可用一般医用注射器进行改装。

本实验采用藻酸钙凝胶包埋法使酿酒酵母固定化，吸附重金属铜离子。

三、实验器材

（1）酿酒酵母。

（2）培养基：YEPD液体培养基，4%藻酸钠溶液（高压灭菌，4℃存放），0.05 mol/L氯化钙溶液（pH 6～8，高压灭菌），15 mg/L铜离子溶液。

（3）仪器：原子吸收分光光度计，水平式离心机，恒温振荡器，磁力搅拌器，蠕动泵。

（4）其他用具：10 mL注射器外套及5#头皮静脉针，100 mL三角烧瓶（无菌），20℃～22℃及37℃水浴，50 mL带盖离心管（无菌），20 mm×120 mm层析柱。

四、操作步骤

（1）培养分离菌体：以无菌操作将酿酒酵母接入YBPD液体培养基中，28℃温度下振荡培养36 h，离心，得到菌体。用无菌水洗涤菌体2次。

（2）制作菌悬液：将2.5 g湿菌体移入5 mL无菌去离子水中，摇匀得到菌悬液。

（3）加入5 mL 4%藻酸钠溶液，充分混匀。

（4）将50 mL 0.05 mol/L氯化钙溶液移入锥形瓶中。将头皮静脉针通过锥形瓶口的棉塞伸入瓶内，并与10 mL注射器连接。将此锥形瓶置于37℃水浴中10 min。

（5）将藻酸钠-菌体混悬液移入注射器中，适度加力，将藻酸钠-菌体悬液滴入0.05 mol/L氯化钙溶液中。

（6）滴完，将锥形瓶移入20℃～22℃水浴中，放置1 h。

（7）倾去溶液，加入100 mL无菌去离子水冲洗1次。(www.xing528.com)

（8）重新加入50 mL 0.05 mol/L氯化钙溶液，4℃平置过夜。

（9）将固定化酵母细胞放入烧杯中，加水浸泡。

（10）在层析柱的底部加入颗粒状硅胶，以增加过滤速度。将烧杯中的已固定化的菌体和水一起倒入层析柱中，用去离子水洗涤至pH为6.0。

（11）配制15 mg/L的铜离子溶液100 mL，过柱，流速控制在5 mL/min。

（12）用原子吸收分光光度计测量流出液中铜离子的浓度。

（13）用1 mol/L硫酸50 mL冲洗层析柱，测量流出按中铜离子的浓度。

（14）用去离子水洗涤至pH为6.0。重复（11）至（13）步。

（15）用原子吸收分光光度计测量流出液中铜离子的浓度。

五、数据处理

按下列公式计算，填入表3-9中。

固定化菌体吸附率=（加入金属离子量-流出金属离于量）/加入金属离子量×100%

酸洗回收率=酸洗得到的金属离子量/固定化菌体吸附量×100%

表3-9　实验数据统计表

六、注意事项

（1）在使用藻酸钙包埋细胞时，应尽量使培养基中不含有钙螯合剂（如磷酸根）。钙螯合剂可导致钙的溶解进而导致凝胶的破坏。

（2）包埋细胞在凝胶珠中分裂或搅拌不当会导致包埋细胞的流失。

（3）由于藻酸钙凝胶网络的孔径尺寸太大，酶会从网络中泄漏出来，因此不适合大多数酶的固定化。

（4）高浓度的钾离子、镁离子、磷酸根以及其他单价金属离子会破坏藻酸钙凝胶的结构。

（5）由藻酸钠制备藻酸钙时，钙离子加入方式对藻酸钙凝胶的性质影响很大。如果钙离子加入太快，会导致局部凝胶化，形成不连续的凝胶结构。可以利用慢速溶解的钙盐来控制钙离子的加入速度。

七、思考题

试分析固定化微生物有什么优点和缺点。