基因工程菌连续培养和降解效率测定实验

一、实验目的

（1）了解连续培养法测定基因工程菌稳定性的原理。

（2）掌握连续培养基因工程菌的操作技术和方法。

二、实验原理

由于外源蛋白的表达增加了微生物代谢负担，基因工程菌在培养过程中会出现不稳定现象，表达质粒丢失导致目的蛋白产量下降。因此，在生产过程中要首先确定菌株的稳定性。

连续培养装置（图3-4）利用限制性底物来控制微生物的生长速度，保持体系中微生物的浓度始终处于一定的值。连续培养重要的控制参数是稀释度（D）。

D=f/V

其中f为底物流入速度，V为连续培养装置中培养液体积。

当稀释度与体系中微生物的比生长速率μ相同时，只要μ不超过其最大比生长速率μmax就可以保持体系的连续培养。细菌的比生长速率可以用以下公式计算：

μ=0.693/g（g为在一定条件下细菌的代时）

通过测定大肠杆菌在连续培养条件下的代时，就可以确定稀释度，从而建立基因工程菌的连续培养体系。

图3-4　简单连续培养装置示意图

通过测定连续培养过程中基因工程菌降解甲基对硫磷的能力，就可以确定降解菌的稳定性。工程菌降解甲基对硫磷后产生的对硝基苯酚在pH为10的条件下呈现稳定的黄色。因此，可以通过比色法测定其在410 nm处的OD值获得对硝基苯酚的产量，从而测定工程菌对甲基对硫磷的降解能力。

三、实验器材

（1）菌种：大肠杆菌BL21（含p ET-mpd）。

（2）培养基及试剂：LB培养基（含IPTG 0.5 mmol/L），甲基对硫磷（50%乳油），对硝基苯酚（分析纯），甘氨酸-氢氧化钠缓冲液（pH 10）。

（3）仪器：紫外分光光度计，台式高速离心机，超声波破碎仪，连续培养装置。

四、实验步骤

1.对大肠杆菌（BL21）的代时测定(www.xing528.com)

以LB为培养基测定BL21菌的生长曲线，以对数初期代时作为连续培养时的代时，计算其比生长速率。此比生长速率可以作为连续培养时的稀释度的近似值。

2.连续培养体系的建立

在连续培养装置中接种BL21菌，培养至OD值达到0.6。按f=V×μ的流速流加LB培养基，同时定时检测流出液的OD值，直至OD值稳定。

3.降解菌活性的测定

OD值稳定后，每2 h取样5 mL，破碎菌体细胞，取上清液测定蛋白质含量及酶活。蛋白质含量采用紫外比色法测定，分别测定OD260和OD280，按公式C pr=1.55OD280-0.75OD260估算蛋白质浓度。

建立以下反应体系测定工程菌降解能力：

于5 mL pH 8.8的巴比妥-盐酸中依次加入1μL上清液、1μL甲基对硫磷（50%乳油），4℃反应20 min。取0.5 mL反应液加入到4.5 mL甘氨酸-氢氧化钠缓冲液中，于410 nm处测定OD值。

4.不同浓度对硝基苯酚的OD410标推曲线的建立

配置0.1%对硝基苯酚母液，取相应体积至9.5 mL pH 10.0甘氨酸-氢氧化钠缓冲液中，于410 nm处测定OD值，计算回归方程（表3-8）。

5.作图

根据不同取样时间测定的工程菌降解能力对时间作图，考察工程菌的稳定性。

表3-8　各组分添加量一览表

五、数据处理

（1）计算大肠杆菌BL21在LB中培养时的代时。

（2）绘制不同浓度对硝基苯酚的OD410标准曲线。

（3）计算不同培养时期工程菌降解酶的活性。

六、思考题

在保证菌株性能稳定的条件下，比较分批培养与连续培养的优缺点。