质粒DNA分离纯化及鉴定

一、实验目的

（1）了解质粒DNA分离、纯化和鉴定的原理。

（2）掌握用碱裂解法小量制备质粒DNA的方法。

二、实验原理

质粒是独立存在于染色体外的双链环状DNA分子，可以从细菌中以超螺旋的形式被分离纯化。它独立于宿主染色体外进行复制和遗传，并且赋予宿主细胞一些表型。通常用作基因工程的质粒载体含有遗传选择标记，可以在相应的选择条件下赋予宿主生长优势。

质粒提取的方法通常有碱裂解法、煮沸法等多种。碱裂解同时结合去垢剂SDS可从细菌中分离质粒DNA。当细菌悬液与高pH的强阴离子去垢剂混合后，细胞壁被破坏，染色体DNA和蛋白质变性，质粒DNA被释放到上清溶液中。尽管碱溶液完全打断了碱基配对，但由于环形质粒DNA在拓扑结构上是相互缠绕在一起的，因此质粒的DNA双链不会彼此分开。只要处理不太剧烈，当pH恢复中性后DNA的两条链会立即置新配对。

在裂解过程中，细菌蛋白质、破碎的细胞壁以及变性的染色体DNA形成一些网状的大复合物，表面被十二烷基硫酸包裹。当钠离子被钾离子取代时，这些复合物将被有效地从溶液中沉淀出来。当变性物通过离心被去除后，可从上清液中得质粒DNA。

三、实验器材

1.菌株和质粒

大肠杆菌DH5α，携带有p UC19质粒。

2.缓冲液

（1）溶液Ⅰ：50 mmol/L葡萄糖，25 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0），10 mmol/L EDTA（pH 8.0）。

溶液Ⅰ一次可配制约100 mL，在121℃高压蒸汽灭菌15 min，保存于4℃。

（2）溶液Ⅱ：0.2 mol/L氢氧化钠（从10 mol/L贮存液中现用现稀释），1%SDS（从10%SDS贮存液中现用现稀释）。

（3）溶液Ⅲ：5 mol/L乙酸钾60 mL，冰乙酸11.5 mL，水28.5 mL。所配成的溶液中钾的浓度为3 mol/L，乙酸根的浓度为5 mol/L。

3.试剂

实验所需试剂如下：无水乙醇、冰预冷的70%乙醇、酚/氯仿、TE（pH 8.0）、TE（pH 8.0，含20μg/mL RNase A）、LB培养基、氨苄青霉素。

4.实验仪器和其他用具

实验所需仪器和其他用具包括摇床、振荡混合器、离心机、微量取液器、枪头、eppendorf管等。

四、实验步骤

1.质粒DNA的小量快速提取

（1）挑取大肠杆菌DH5α单克隆，接种到含有100μg/mL氨苄青霉素的2 mL LB培养液中，37℃、250 r/min培养过夜。

（2）用1.5 mL的微量离心管收集1.0 mL菌液，以最高速度离心30 s，剩余的菌液保存于4℃。

（3）尽量去除上清液。注意：尽可能去除残存的液体，否则残存物质可能影响限制性内切酶对质粒DNA的切割。

（4）加入100μL冰预冷的溶液Ⅰ，在振荡器上剧烈振荡，使细菌完全悬浮。

（5）加200μL新鲜配制的溶液Ⅱ，盖紧盖子，快速颠倒5次，以混匀溶液，确保整个管子表面都与溶液Ⅱ接触。切勿振荡，否则易造成质粒DNA断裂。

（6）加150μL冰预冷的溶液Ⅲ。盖紧盖子，颠倒数次以保证溶液Ⅲ与黏稠的裂解物混合均匀，置冰上3～5 min。切勿振荡，否则易造成质粒DNA断裂。

（7）在4℃的条件下，以最高速度离心5 min，将上清液转移到新的离心管中。

（8）加等体积的酚/氯仿，盖紧盖子，振荡30 s。在4℃条件下以最高速度离心2 min，将上清液转移到新的离心管中。

（9）加等体积的氯仿，盖紧盖子，振荡30 s。在4℃条件下以最高速度离心2 min，将上清液转移到新的离心管中。(www.xing528.com)

（10）加2倍体积的无水乙醇，振荡混匀后置室温2 h。

（11）在4℃的条件下，以最高速度离心5 min。

（12）小心吸除上清液。将离心管倒置在吸水纸上，吸干流出的液体。尽量吸干管壁的液滴。注意：尽可能去除残存的液体，否则残存物质可能影响限制性内切酶对质粒DNA的切割。

（13）加1 m 17%的乙醇。颠倒管子数次。在4℃条件下以最高速度离心2 min。

（14）按步骤（12）的方法，吸除上清液。注意要十分小心，因此时沉淀与管底贴附不紧。

（15）将离心管敞开盖子置室温5～10 min，直至管中的液体完全蒸发。注意：质粒DNA不宜过于干燥，不然将难以溶解，并可能变性。

（16）用50μL含20μg/mL RNase A的TE（pH 8.0，无DNase）溶解DNA。振荡若干秒钟，保存于-20℃。

2.质粒DNA的纯化（PEG法）

（1）加等体积饱和酚，混匀，以12 000 r/min的转速在室温条件下离心5 min。

（2）取上清液，加等体积氯仿，混匀，以12 000 r/min的转速在室温条件下离心5 min。

（3）取上清液，加等体积13%PEG 8 000，置冰上放置30 min。

（4）以12 000 r/min的转速在室温条件下离心10 min，弃上清液，用TE溶解备用。

3.DNA电泳检测

（1）用1×TAE配制0.7%的琼脂糖凝胶。

（2）置微波炉中加热至沸腾。

（3）按1 ng/100 mL的量加入溴化乙啶。

（4）待稍冷却后倒入胶槽中，制备DNA检测用凝胶。

（5）待凝胶完全凝固后.将凝胶放入电泳槽中。在电泳槽中加入1×TAE至液面恰好漫过凝胶表面。

（6）吸取10μL DNA样品与1μL 10×电泳样品缓冲液混匀。

（7）将样品加入凝胶的样品孔中。

图3-3　λ Hind Ⅲ marker电泳示意图谱

（8）在实验组样品旁的样品孔中加入5μL DNA Marker（图3-3）。

（9）在加样孔侧接负电极，相反方向接正电极，以5 V/cm的恒定电压电泳。

（10）电泳结束后，将凝胶取出，置紫外暗箱观察DNA样品的电泳情况，进行记录或拍照。

五、实验结果

绘图表示质粒的电泳情况，并依据DNA Marker判断片段的大小。

六、注意问题

所用离心管及枪头在使用前必须灭菌。