实验：PCR测定方法

一、实验目的

（1）了解PCR反应的基本原理。

（2）掌握利用PCR反应扩增DNA的操作技术和方法。

二、实验原理

聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法，故又称基因的体外扩增法。DNA不需通过克隆而在体外扩增，短时间内合成大量DNA片段。待扩增的DNA片断和与其两侧互补的寡核苷酸引物，经变性、退火和延伸若干个循环后，DNA扩增2n倍。它广泛应用于法医鉴定、医学、卫生检疫和环境检测等方面。因PCR检测速度快，只需5～6 h就可了解结果，深受检测单位关注，并被积极研究和应用。

1.PCR扩增DNA

PCR是天然DNA复制过程的模拟，即对特定核酸基因片段进行体外扩增的技术。典型的PCR反应体系包括DNA模板，反应缓冲液，脱氧核苷三磷酸（d NTP），Mg2+，上、下游引物、耐热TaqDNA聚合酶。PCR过程包括变性、退火和延伸3个阶段。从理论上讲，每经过一个循环，样本中的DNA量增加一倍，新形成的链又可成为新一轮循环的模板，经过20～30个循环后DNA可扩增106～109倍。

2.DNA检测

常用琼脂糖凝胶电泳检测提取的DNA和PCR产物。DNA分子在碱性电泳缓冲液中带负电荷，在电泳仪外加电场的驱动下向正极泳动。DNA片段的相对分子质量大小和构型决定着电泳速率及分离效果。以双链线性DNA为例，不同相对分子质量DNA的电泳分离需要使用不同浓度的琼脂糖凝胶。DNA片段越小，所需琼脂糖凝胶浓度越高。电泳完成后，使用溴化乙啶（EB）、Goldview或SYBRGreen等核酸染料对凝胶中的DNA进行染色。结合了上述染色剂的DNA分子在紫外光照射下发射荧光，且荧光强度与DNA的含量成正比。可使用凝胶成像系统进行成像，并对成像图谱进行分析。

三、实验器材

1.仪器

所用仪器如下：PCR仪、电泳仪及水平电泳槽、紫外照射仪、离心管、高速离心机、震荡混合器、PCR管、微量移液器及枪头。

2.试剂

（1）10×PCR缓冲液（10～50 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5～9.0，6～50 mmol/L KCl），MgCl2溶液（10 mmol/L），蒸馏水。

（2）4×d MTP（每种25 mmol）。

（3）Tag酶1 U/μL。

（4）β-actin DNA模板（1 nmol/L）。

（5）扩增β-actin目的片段的寡核苷酸引物（10μmol/L）购自Promega公司。(www.xing528.com)

正向引物（引物Ⅰ）序列：TCATGAAGTGTGACGTTGACATCCG；负向引物（引物Ⅱ）序列：CCTAGAAGCTTTGCGGTGCACGATG。

四、操作步骤

（1）取2个PCR管，分别用作空白对照和实验管，用记号笔做好标记。放置在冰上。

（2）向空白对照和实验管中分别加入表3-4中所列试剂。每加一种试剂要换一个枪头。

（3）盖好管子，在振荡器上振荡混匀。

（4）置高速离心机中短暂离心。

表3-4　PCR反应体系

（5）将PCR管放入预热至94℃的PCR仪中，按下列程序开始反应：①94℃，变性30 s。②60℃，退火30 s。③72℃延伸1 min。④重复①～③25次。⑤72℃延伸5 min。⑥反应结束后将PCR管取出，4℃保存直至电泳分析。

五、电泳检测结果分析

使用琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。电泳结束后，将电泳凝胶放到紫外照射仪中观察，若电泳凝胶显示清晰的条带，则实验成功。

六、注意事项

（1）每个PCR实验必须有一个阴性对照和阳性对照。阳性对照是为了检测PCR的效率，而阴性对照是检测反应体系中是否有目标DNA的污染。本实验的实验管即为阳性对照。

（2）对于步骤（5），如果PCR仪无热盖，则应在PCR管中加一滴石碏油以防止PCR反应时液体蒸发。反应结束后，可在管中加入100μL的氯仿抽提去除石碏油。

七、思考题

在添加完样品和试剂后要离心，离心的目的是什么？