环境中的致癌物：Ames法监测成果！

一、实验目的

（1）了解Ames法快速检测环境致癌物的原理。

（2）掌握Ames法快速检测环境致癌物的操作技术和方法。

二、实验原理

由于传统的动物实验法检测环境中的致癌物耗时费力，Ames试验作为一种快速准确的微生物检测法得到了广泛应用。

Ames法利用鼠伤寒沙门氏菌的组氨酸缺陷型（his-）菌株的回复突变来判断被检物质是否具有诱变性和致癌性，并能区别突变的类型（置换突变或移码突变）。在不含组氨酸的基本培养基上，鼠伤寒沙门氏菌组氨酸营养缺陷型（his-）菌株不能生长；若遇到诱变性物质，这些菌株发生回复突变（his-→his+）形成野生型菌株，可以在不含组氨酸的基本培养基上生长，形成肉眼可见的菌落（图3-1）。根据存在和不存在被检物质时回复突变的频率，可以推断该物质是否具有诱变性或致癌性。

图3-1　Ames试验

左图对照滤纸圈上不加化学物质，右图试验滤纸圈上添加化学物质。比较左图和右图可见，添加化学物质后，滤纸圈周围的菌落数明显增加

这组检测菌株含下列突变：

（1）组氨酸基因突变（his-）：根据选择性培养基上his-菌株的回复突变率就可测出被检物的致突变率或致癌率。

（2）脂多糖屏障丢失（rfa）：该菌株的细胞壁上失去脂多糖屏障，待测物容易进入细胞。

（3）紫外线切割修复系统缺失（Δuvr B）及生物素基因缺失，使致癌物引起的遗传损伤的修复降到最低程度。

（4）具抗药质粒R因子，使该菌抗氨苄青霉素，从而提高了灵敏性。

常用的几株鼠伤寒沙门氏菌为TA1535、TA1537、TA1538、TA98、TA100、TA97及TA102。TA98可以检出能引起DNA移码突变的诱变物质。

有的致癌物是被哺乳动物肝细胞中的微粒体羟化酶系统（简称S-9混合液）活化后才显示诱变性或致癌性，而细菌没有这种酶系统，故加入鼠肝匀浆的酶系统能增加检测的灵敏度。哺乳动物匀浆中可以分离到小球状的内质网碎片，即为微粒体。Ames实验也称为鼠伤寒沙门氏菌/哺乳动物微粒体实验。

Ames试验不是验证化学致癌物的决定性的实验，但是试验结果阳性和致癌之间有十分明显的相关性。Ames法的优点：简便、易行、灵敏、检出率高，90%的化学致癌物都可获得阳性结果，不需特殊器材，易推广。缺点：微生物的DNA修复系统比哺乳动物简单，基因不如哺乳动物多，不能完全代表哺乳动物的实际情况。

三、实验器材

1.菌种

鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）TA98、TA102菌株（组氨酸-生物素缺陷型，测试菌株），野生型S-CK菌株（对照菌株）

2.试剂

牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、柠檬酸、七水合硫酸镁、磷酸氢二钾、磷酸氢铵钠、葡萄糖、L-组氨酸、d-生物素、琼脂、辅酶Ⅱ（NADP）、葡萄糖-6-磷酸（G-6-P）、六水合氯化镁、氯化钾、磷酸氢二钠、一水合磷酸二氢钠、结晶紫、氨苄青霉素、四环素、蒸馏水等。化学试剂要求至少为分析纯。

3.培养基

（1）底层培养基。①葡萄糖（20%）：20 g葡萄糖加入盛有100 mL蒸馏水的锥形瓶中；0.072 MPa下112℃灭菌20 min。②柠檬酸2 g；磷酸氢二钾10 g；七水合硫酸镁0.2 g；四水合磷酸氢铵钠3.5 g；琼脂（优质）15 g；蒸馏水900 mL；pH为7.0；加热溶解，混匀，0.103 MPa下121℃灭菌20 min。将灭菌后的①②在80℃左右时混匀，待降温至45℃～50℃时倒入无菌平皿。每皿倒入1/4～1/3皿高的培养基，平放桌上，待凝固成平板。

（2）表层培养基。①组氨酸-生物素混合液。称取1.22 mg d-生物素、0.77 mg L-组氨酸加入盛有10 mL温热蒸馏水的锥形瓶中即可。②称取0.5 g氯化钠，0.6 g优质琼脂，加入盛有100 mL蒸馏水的三角烧瓶中，加热、搅拌至完全溶解；再加入10 mL组氨酸-生物素混合液，加热、混匀、趁热分装于13 mm×100 mm的小试管，每支3 mL，每管加2.5 mL，121℃灭菌20 min。表层培养基用于样品致突变性实验。

（3）营养肉汤：牛肉膏0.5%、蛋白胨1%、NaCl 0.5%，用2 mol的氢氧化钠调pH为7.2，0.103 MPa下121℃高压蒸汽灭菌20 min。营养牛肉汤用于制备试验菌液。

（4）营养琼脂：在上述营养肉汤中加2%的琼脂，据需要分装后置于0.103 MPa 121℃高压蒸汽灭菌20 min，冷至50℃左右时倒入无菌平皿。营养琼脂用于菌种基因型（rfa\△uvrB）鉴定。

4.待测化合物

将待测物配制成不同浓度溶液，通常至少设3个浓度梯度。据待测物情况，每0.1 mL待测液中可含待测物百分之几微克至上千微克，最高不能超过该物的抑菌浓度。能溶于水的物质可用无菌蒸馏水配制；不溶或者难溶于水的样品可用二甲基亚砜（DMSO，光谱纯或分析纯）作为待测液的溶剂；对于既不溶于水又不溶于二甲基亚砜的样品，可选用95%的乙醇、丙酮、甲酰胺、乙腈、四氢呋喃等作为配制待测液的溶剂。待测液配好后贴上标签，冰箱保存备用。

5.阳性对照物（验证性致突变物）

原则上要求所用阳性物应易获得、具代表性并对人体的毒性较低。本实验推荐使用的阳性对照物见表3-1和表3-2。

表3-1　掺入法中使用的阳性物

注：①表中3栏至7栏中的数字表示每皿回复突变菌落数，仅供参考。②致突变性用“-”“+”及数目多少表示致突变性为阴性或阳性及强弱。阴性（-）：出现的诱发回复突变菌落数为自发回复突变数的2倍以上；弱阳性（+）：诱发回复突变菌落数为自发回复突变数的2～10倍；阳性（++）：诱发回复突变菌落数为自发回复突变数的10～50倍；强阳性（+++）：诱发回复突变菌落数为自发回复突变数的50倍以上

表3-2　点试法中使用的阳性物

(www.xing528.com)

注：①表中3栏至7栏中的数字表示每皿回复突变菌落数，仅供参考。②致突变性用“-”“+”度数目多少表示致突变性为阴性或阳性及强弱。阴性（-）：出现的诱发回复突变菌落数为自发回复突变数的2倍以上；弱阳性（+）：诱发回复突变菌落数为自发回复突变数的2～10倍；阳性（++）：诱发回复突变菌落数为自发回复突变数的10～50倍；强阳性（+++）：诱发回复突变菌落数为自发回复突变数的50倍以上

6.实验仪器

实验所需仪器如下：高压灭菌器、干热灭菌器、培养箱、冰箱、恒温摇床、混匀器、分析天平、培养皿、移液管、小试管、锥形瓶、量筒、吸管、称量瓶、分光光度计、定量加样器、紫外光灯。

另外需要制备肝匀浆的器皿：注射器、台秤、剪刀、烧杯、匀浆管、高速离心机、血清瓶。

7.肝微粒体酶系（S-9上清液）及S-9混合液

（1）制备肝匀浆：所用器皿、刀剪、溶液都需保持无菌，并在0℃～4℃下（也可在冰浴中）操作。选健康的成年雄性大白鼠3只（每只体重在300 g左右），称重，每千克体重腹腔注射诱导物五氯联苯油溶液500 mg（五氯联苯油溶液用玉米油配制，浓度为200 mg/mL）提高酶活力。注射后第5天杀鼠，杀前大鼠禁食12 h（可饮水）。取3只大白鼠的肝脏合并后称重，用0.15 mol/L氯化钾溶液洗涤3次，剪碎，每克肝脏（湿重）加3 mL 0.15 mol/L氯化钾溶液，制成肝匀浆。

（2）制备S-9上清液：肝匀浆经以9 000 r/min的转速离心10 min，取上清液（即S-9）分装至小试管，每管1～2 mL，液氮速冻，-80℃冷藏备用。

（3）配制S-9混合液：每50 mL S-9混合液的成分组成见表3-3。

表3-3　S-9混合液配方

配制S-9混合液前，可预先将表3-3中各组分配制成贮备液。0.1 mol/L的NADP及1 mol/L的葡萄糖-6-磷酸在配好后可用0.22μm滤膜过滤除菌；也可直接在已灭菌的具塞试管内用无菌蒸馏水配制而不需过滤。用蒸馏水配制氯化钾（1.65 mol/L）和氯化镁（0.4 mol/L）的混合盐溶液（一种溶液中含有此两种盐）及0.2 mol/L的磷酸缓冲液（每520 mL缓冲液由60 mL 0.2 mol/L的一水合磷酸二氢钠和440 mL的0.2 mol/L的一水合磷酸氢二钠组成），经121℃高压蒸汽灭菌20 min，普通冰箱贮存备用。取无菌锥形瓶置于冰浴中，按照表3-3由下到上依次混合各组分，整个操作过程要求在无菌、低温（0℃）的条件下进行。S-9混合液应现用现配，用后的剩余部分弃掉。

S-9上清液的适宜用量：S-9混合液中的S-9上清液用量过多或过少都会降低间接致突变物活性的表现。常规筛检实验中，首先使用标准S-9混合液（见表3-3）。若此情况下样品实验结果为阴性，则应增加S-9上清液的用量，配成高浓度的S-9混合液重新进行实验。

8.母板：氨苄青霉素平板和氨苄青霉素/四环素平板

配制母板准备如下：琼脂15 g、蒸馏水680 mL、VB培养基E 200 mL、20%葡萄糖、无菌L-盐酸组氨酸一水物（L-组氨酸·HCl·H 2 O，2 g/400 mL蒸馏水）10 mL、无菌0.5 mmol/L d-生物素6 mL、8 mg/mL氨苄青霉素溶液（用无菌的0.02 mol/L氢氧化钠水溶液配制）3.15 mL、8 mg/mL四环素溶液（用无菌的0.02 mol/L盐酸配制）。

琼脂放入蒸馏水中，121℃、0.103 MPa灭菌20 min，趁热混入无菌的葡萄糖、VB培养基E和L-组氨酸溶液，混匀，冷却至50℃左右，再加入无菌d-生物素及氨苄青霉素。对用于TA102菌株培养的平板，还应再加入无菌四环素溶液，此平板在4℃下可保存2个月。平板倒好后应及时接种，37℃培养48 h，置于冰箱保存。氨苄青霉素平板用于保存和鉴定具R因子的菌株；氨苄青霉素/四环素平板用于保存和鉴定TA102菌株的p AQ1质粒及R因子。

四、实验前实验菌液的准备

用无菌小勺刮取适量的冻干菌种或直接由母板挑取适量的菌落接种于10 mL营养肉汤中（增菌肉汤用50 mL锥形瓶盛）。接种后将培养液置于37℃摇床（120 r/min）培养10～12 h，此时菌液浓度要求达到每毫升1×109～2×109个。菌液浓度的判断可参照多次活菌计数的结果；或者在650 nm波长下测其透光率，以透光率作为菌液浓度参数。试验菌液符合要求后应尽快投入实验。

五、实验步骤

1.致突变性实验

（1）掺入法：先在平皿上编号标记，每种菌株每一测试浓度应设立三皿平行。取熔化并保温于45℃水浴的表层培养基一管，依次加入下列组分：实验菌液0.1 mL、S-9混合液0.5 mL、待测液0.1 mL，在电动混匀器上充分混匀约3 s后，迅速倒在底层培养基上，使表层培养基均匀铺于底层培养基上，放实验台上冷凝。上述操作要动作迅速，保证在20 s内完成，注意避光。将凝固后的平板放于恒温箱37℃培养48 h，观察结果。测试未知样品应在S-9条件下同时进行。

（2）点试法：标记平皿，取熔化后并保温在45℃水浴的表层培养基一管，依次加入下列组分：实验菌液0.1 mL、S-9混合液0.5 mL，在电动混匀器上充分混匀约3 s后，迅速倒在底层培养基上，使表层培养基均匀铺于底层培养基上，放实验台上冷凝。用直径6 mm的无菌滤纸片沾取10μL左右的待测液，轻放于已凝固的表层琼脂上，每皿可放滤纸片1～5张。将平皿放于恒温箱37℃培养48 h，观察结果。

2.对照

为保证Ames实验的可靠性，在检测样品时，每次实验均需做自发回复突变对照、阳性对照及阴性对照。自发回复突变对照是指在表层培养基中不加待测液，只加实验菌液，在S-9混合液条件下观察每皿回复突变菌落数。阴性对照物为配制待测样品所用的溶剂。阳性对照是在实验平皿中加入已知致突变物，考察实验的敏感度和可靠性（阳性物选用见表3-1和表3-2）。

六、结果与评价

1.掺入法结果

准确计数实验平皿上的回复突变菌落数，计算每组数据的平均数，并以“回复突变菌落均数±标准误差”来表示。凡诱变菌落平均数为自发回复突变菌落平均数的2倍或2倍以上且具有一定的剂量反应关系者，认为该待测物Ames实验阳性，为致突变物。实验结果也可用突变率（MR=Rt/Rc）表示。

只有当突变率≥2时，才认为Ames实验阳性。对于纯化学待测物，当实验浓度达每皿500μg（或达到对测试菌株无抑制作用的最大剂量）仍未见阳性结果时，便可报告该待测物为Ames实验阴性。

对阳性结果的化合物，其试验结果数据要经统计分析（计算剂量与回变菌落均数之间的相关系数，并进行相关显著性检验），确证具可重复的剂量反应关系，方能最后确认其为阳性。

2.点试法结果

凡在点样纸片周围长出一圈密集可见的his+回复突变菌落者，即可初步认为该待测物为致突变物。如仅在平板上出现少数的散在菌落则为阴性。

无论是掺入法还是点试法检测，实验平皿琼脂表面his+回复突变菌落下均会有一层菌苔作为背衬。观察结果时，一定要见到此层菌苔方可确认his+回复突变菌落。该菌苔系his+菌株利用表层培养基中所含的微量组氨酸生长分裂数次后所形成的。这种生长对产生诱变作用是必要的。

七、思考题

（1）实验中要注意哪些问题？

（2）实验中添加S-9混合液有何意义？