水中大肠菌群检测-滤膜法实验结果

一、实验目的

（1）掌握滤膜法检测水中大肠菌群的方法。

（2）了解大肠菌群数量在饮用水中的意义及其生化特性。

二、基本原理

总大肠菌群的检测方法主要有多管发酵法和滤膜法。多管发酵法（MPN法）被称为水的标准分析法，该法较烦琐，适用于饮用水、水源水，尤其是混浊度高的水中总大肠菌群的测定。滤膜法是一种快速的替代方法，能测定大体积的水样，但只局限于饮用水或较洁净的水。直接从所用的滤膜培养基上数出的菌落数即为检测结果。目前，在一些大城市的水厂常采用此法。

滤膜是一种微孔薄膜，直径一般为3.5 cm或4.7 cm，厚度为0.1 mm，孔径为0.45～0.65μm，能滤过大量水样，并将水中含有的细菌截留在滤膜上。将滤膜贴在添加乳糖的鉴别培养基上，37℃恒温培养24 h后，直接计数在滤膜上生长的典型大肠菌群菌落，计算出每100 mL水样中含有的总大肠菌群数。

三、实验器材

除了多管发酵法的器材（实验2-8）外，还有过滤器，抽滤设备，无菌镊子，培养皿（Φ60 mm）和滤膜（直径3.5 cm或4.7 cm）等。

四、实验准备

1.品红亚硫酸钠培养基

品红亚硫酸钠培养基即远滕氏培养基，供滤膜法用。

（1）配方：蛋白胨10 g，酵母浸膏5 g，牛肉膏5 g，乳糖10 g，磷酸氢二钾3.5 g，琼脂20 g，蒸馏水1 000 mL，无水亚硫酸钠5 g左右，质量浓度为50 g/L的碱性品红乙醇溶液20 mL。

（2）储备培养基的制备：将琼脂加入900 mL蒸馏水中加热溶解，再分别称取磷酸氢二钾及蛋白胨、酵母浸膏、牛肉膏，混匀，溶解，补足蒸馏水至1 000 mL，调整pH为7.2～7.4。趁热用脱脂棉或绒布过滤（无杂质可不过滤），再加入乳糖，混匀，定量分装于锥形瓶内，包装，0.072 MPa、115℃灭菌15～20 min。放于阴暗处备用。

（3）平板培养基的配制：将储备培养基融化。用无菌移液管吸取一定量的质量浓度为50 g/L的碱性品红乙醇溶液于无菌空试管中。按比例称取所需的无水亚硫酸钠置于另一无菌空试管中，加入无菌水少许，使其溶解后置于沸水浴中煮沸10 min灭菌。用无菌移液管吸取无水亚硫酸钠溶液，滴加于碱性品红乙醇溶液至深红色褪成淡粉色为止。将此亚硫酸钠与碱性品红的混合液全部加到已融化的储备培养基中，充分混匀，倒平板，备用（若存冰箱不宜超过2周）。如果培养基已由淡粉色变成深红色，则不能再用，需重新配制。

本培养基可不加琼脂，制成液体培养基，使用时加2～3 mL于灭菌吸收垫上，再将滤膜置于吸收垫上培养。

2.乳糖蛋白胨培养液

同实验2-8中乳糖蛋白胨培养基的配制。

3.乳糖蛋白胨半固体培养基(www.xing528.com)

蛋白胨10 g，酵母浸膏5 g，牛肉膏5 g，乳糖10 g，酵母浸膏5 g，琼脂5 g，蒸馏水1 000 mL，pH 7.2～7.4。

灭菌：0.072 MPa压力下115℃灭菌15～20 min。

五、实验步骤

1.滤膜和滤器灭菌

滤膜灭菌时，将滤膜放入烧杯中，加入蒸馏水，置于沸水浴中煮沸灭菌（间歇灭菌）3次，每次15 min。前两次煮沸后需更换蒸馏水洗涤2～3次，除去残留溶剂。

滤器灭菌。将滤器置于高压灭菌器，121℃、0.103 MPa灭菌20 min。

2.过滤水样

用无菌镊子夹住滤膜边缘，粗糙面向上，贴在滤器上。固定好滤器，将100 mL水样（若水样含菌多，可减少过滤水样量）注入滤器中，加盖，打开滤器阀门，在-5.07×104 Pa（-0.5 atm）下抽滤。

3.培养

水样过滤后，再抽气5 s。关上滤器阀门，取下滤器。用镊子夹住滤膜边缘移放在品红亚硫酸钠培养基平板上，滤膜截留细菌面向上。滤膜应与培养基完全贴紧，两者间不得留有气泡。倒置平皿，置于恒温培养箱37℃培养22～24 h。

4.观察结果

挑取符合如下特征的菌落，进行涂片、革兰氏染色、镜检：①深紫黑色，具有金属光泽的菌落；②紫黑色，不带或略带金属光泽的菌落；③淡紫红色，中心颜色较深的菌落；④紫红色的菌落。

将具备上述特征、革兰氏染色阴性、无芽孢杆菌接种到乳糖蛋白胨培养液或乳糖蛋白胨半固体培养基。经37℃培养，前者于24 h内产酸产气者，或后者经6～8 h培养产气者，均为大肠菌群。据滤膜上生长的大肠菌群菌落数和过滤的水样体积，即可计算出每100 mL水样中的大肠菌群数，得出实验结果。计算公式如下：

对于不同来源和不同水质的水样，采用滤膜法测定大肠菌群应考虑过滤不同体积的水样，以便得到较好的实验数据。

六、思考题

试比较滤膜法与多管发酵法检测大肠菌群有哪些不同？