水中细菌总数测定实验-环境工程微生物学

一、实验目的

（1）掌握水样采集方法和水中细菌总数测定方法。

（2）了解水质评价的微生物学卫生标准。

二、基本原理

测定水样是否符合饮用水标准，通常主要包括两个细菌学指标：每毫升水的细菌总数和每升水的总大肠菌群数。水中的细菌总数可以用来说明水体卫生状况和被有机物污染的程度。细菌总数是指1 mL水样加入普通琼脂培养基中，37℃下培养24 h后生长出的菌落数。我国规定1 mL生活饮用水中细菌总数不能超过100个。本实验采用平板菌落计数法测定水中细菌总数。

三、实验器材

（1）牛肉膏蛋白胨培养基，灭菌水。

（2）仪器及用具：无菌的带玻璃塞瓶，无菌培养皿，灭菌吸管，无菌试管，三角烧瓶等。

四、实验步骤

1.水样采集

（1）自来水收集：事先将水龙头用火焰烧灼3 min，放水5 min，用无菌三角烧瓶接取水样。

（2）湖水、河水或池水采集：将灭菌的带玻璃塞瓶的瓶口向下浸入池水、河水或湖水中至距水面10～15 cm的深层，然后翻转过来，除去玻璃塞。盛满水后，将瓶塞塞好，再从水中取出。水样须立即进行检测，否则须放入冰箱保存。

2.细菌总数测定

自来水细菌总数测定步骤如下：

（1）接种：取2个培养皿，分别通过无菌操作用吸管吸取1 mL水样，注入培养皿中。

（2）倒平板：将已融化并冷却到45℃左右的无菌牛肉膏蛋白胨琼脂培养基15 mL倒入已加水样的培养皿中，将平皿在桌面上轻轻旋摇，使水样与培养基混匀。

（3）倒空白平板：另取一无菌平皿，与（2）同法倒平板，不接种，作为空白对照。

（4）培养：培养基凝固成平板后置于恒温培养箱37℃培养24 h。(www.xing528.com)

（5）观察、计数：两个平板的菌落数平均值即为1 mL水样的细菌总数。

湖水、河水或池水细菌总数测定步骤如下：

（1）编号：取3支试管，分别编号1号、2号、3号。

（2）水样稀释：3支试管内分别加入9 mL灭菌水，取1 mL水样加入1号试管内，摇匀；再自1号试管内取1 mL水加入2号管，摇匀；再自2号管取1 mL水样加入3号管，摇匀，如此进行梯度稀释，得到10-1、10-2、10-3 3个连续稀释度。稀释倍数据水样污浊程度而定，以培养后平板的菌落数在30～300个的稀释度最为合适。若3个稀释度的菌落均多到无法计数或少到无法计数，则需继续稀释或减小稀释倍数，甚至不稀释。一般中等污染水样，取10-1、10-2、10-3 3个连续稀释度，污染严重的取10-2、10-3、10-4 3个连续稀释度。

（3）接种：在最后3个稀释度的试管中，用无菌吸管各取1 mL稀释样品，加入空的灭菌培养皿中，立即放在桌上摇匀。

（4）倒平板：方法同自来水细菌总数测定步骤（2）。每个稀释度做2～3个平板。

（5）培养：平板凝固后倒置于37℃恒温培养箱中培养24 h。

3.观察、菌落计数

（1）平板菌落数的选择：应选择菌落数为每皿30～300个的稀释倍数计数。先计算相同稀释度的平均菌落数。若其中一个平板有较大片状菌苔生长时，则不应采用，而应以无片状菌苔生长的平板作为该稀释度的平均菌落数。若片状菌落的大小约为平板的一半，而另一半菌落分布又很均匀时，则可按半个平板上的菌落数的2倍作为全平板的菌落数，然后再计算该稀释度的平均菌落数。

（2）稀释度的选择：①当只有一个稀释度的平均菌落数符合每皿30～300个时，该平均菌落数乘其稀释倍数即为该水祥的细菌总数（表2-2例次1）。②若有两个稀释度的平均菌落数均在每皿30～300个，则由稀释度低的平均菌落数与稀释度高的平均菌落数的比值来决定。比值若小于2，应采取两者的平均数（表2-2例次2）；若大于2，则取其中较小的菌落数（表2-2例次3）。③若所有稀释度的平均菌落数均大于每皿300个，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数作为该水祥的细菌总数（表2-2例次4）。④若所有稀释度的平均菌落数均小于每皿30个，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数作为该水样的细菌总数（表2-2例次5）。⑤若所有稀释度的平均菌落数均不在每皿30～300个的范围，则以最接近每皿300或30个的平均菌落数乘以稀释倍数作为该水样的细菌总数（表2-2例次6）。

表2-2　稀释度选择及菌落总数结果报告方式

4.菌落数的报告

菌落数在100以内时按实有数据报告。菌落数大于100时，则采用两位有效数字，两位有效数字后面的位数，四舍五入。为了简化，也可用科学计数法来表示水样的细菌总数（表2-2）。菌落数为“无法计数”时，应注明水样的稀释倍数。

五、思考题

（1）我国的饮用水的细菌学卫生标准是什么？

（2）测定水中细菌总数有何意义？