微生物菌种液氮超低温冷冻保藏方法

液氮超低温冷冻保藏法适合保藏各种微生物，尤其适合保藏某些不宜用冷冻干燥保藏的微生物。运用此法菌种保藏期较长，不易发生变异。该法已被国外某些菌种保藏机构作为常规保藏方法，也已被我国许多专业菌种保藏机构采用。但该法的应用因需要液氮冰箱等特殊设备而受到一定限制。

一、实验目的

（1）了解微生物菌种液氮超低温冷冻保藏法的基本原理。

（2）学习掌握液氮冷冻法的操作技术。

二、基本原理

在超低温（-130℃）条件下，生物的一切代谢活动停止，但生命仍在延续。将微生物细胞悬浮于含保护剂的液体培养基中，或者把带菌琼脂块直接浸没于含保护剂的液体培养基中，经预先缓慢冷冻后，转移到液氮冰箱内，在液相（-196℃）或气相（-156℃）中保藏。

三、实验器材

（1）菌种：准备保藏的细菌、放线菌、酵母菌或霉菌。

（2）培养基：适于培养待保藏菌种的各种斜面培养基或琼脂平板。

（3）试剂：含10%甘油的液体培养基等。

（4）器皿：安瓿管、打孔器、液氮冰箱、控速冷冻机。

四、实验步骤

（一）准备安瓿管

液氮保藏所用的安瓿管必须能够经受突然温度变化而不破裂，一般采用硼硅酸盐玻璃制品。安瓿管规格一般为75 mm×10 mm或能容纳1.2 mL液体。安瓿管洗刷干净并烘干，管口塞上棉花并包上牛皮纸，高压蒸汽灭菌（0.1 MPa下灭菌20 min），安瓿管编号备用。

（二）准备冷冻保护剂

液氮保藏法一般都需要添加保护剂，通常采用浓度为10%（V/V）甘油或10%（V/V）二甲亚砜作为冷冻保护剂。含甘油溶液需经高压灭菌，而含二甲亚砜溶液则采用过滤法除菌。

如要保藏只能形成菌丝体而不能产生孢子的霉菌，除需制备带菌琼脂块外，还需在每个安瓿管中预先加入一定量含10%（V/V）甘油的液体培养基（加入量以能浸没即将加入的带菌琼脂块为宜）。0.1 MPa压力下灭菌20 min，备用。

（三）制备菌悬液或带菌琼脂块浸液

1.制备菌悬液

在每支培养好菌的斜面中加入5 mL含10%（V/V）甘油的液体培养基，制成菌悬液。用载菌吸管吸取0.5～1 mL菌悬液分装于无菌安瓿管中，然后用火焰熔封安瓿管管口。

2.制备带菌琼脂块浸液

若要保藏只长菌丝体的霉菌时，可用无菌打孔器从平板上切下带菌琼脂块（直径5～10 mm），置于装有含10%（V/V）甘油的液体培养基的无菌安瓿管中，用火焰熔封安瓿管管口。

为了检查安瓿管管口是否熔封严密，可将上述经熔封的安瓿管浸于水中，发现有水进入管内，说明管口未封严。

（四）慢速预冷冻处理

将菌种置于液氮冰箱保藏前，微生物需经慢速冷冻，其目的是防止细胞因快速冷冻而在细胞内形成冰晶，降低菌种存活率。

1.控速冷冻(www.xing528.com)

将已封口的安瓿管置于铝盒中，然后置于一个较大金属容器中，再将此金属容器置于控速冷冻机的冷冻室内，以每分钟1℃的速度冻结至-30℃。

2.普通冷冻

若实验室无控速冷冻机，可将已封口的安瓿管置于-70℃冰箱中预冷冻4 h，代替控速冷冻处理。

（五）液氮保藏

将上述经慢速预冷冻处理的封口安瓿管迅速置于液氮冰箱中，在液相（-196℃）或气相（-156℃）中保藏。

若把安瓿管保藏在液氮冰箱的气相中，则不需要除去安瓿管管口棉塞，也不需要熔封安瓿管管口。

（六）恢复培养

若需用所保藏的菌种，可用急速解冻法融化安瓿管中结冰。从液氮冰箱中取出安瓿管，立即置于38℃～40℃水浴中，并轻轻摇动，使管中结冰迅速融化。采用无菌操作打开安瓿管，用无菌吸管将安瓿管中保藏的培养物全部转移到含有2 mL无菌液体培养基中，再吸取0.1～0.2 mL菌悬液至琼脂斜面上，进行保温培养。

五、注意

（1）安瓿管需要绝对密封。若有漏洞，保藏期间液氮会渗入安瓿管内。从液氮冰箱取出安瓿管时，液氮会从管内逸出。由于室温高，液氮常会因急剧气化而发生爆炸。为防不测，操作人员应戴上皮手套和面罩等防护用具。

（2）皮肤接触液氮时，极易被“冷烧”，操作时应特别小心。

（3）从液氮冰箱取出一支安瓿管时，为防其他安瓿管升温，应尽量缩短取出和放回安瓿管的时间，一般不得超过1 min。

六、思考题

（1）在液氮超低温冷冻保藏法中，需用含保护剂的液体培养基制备菌悬液，为什么？保护剂的作用是什么？

（2）用什么方法检查安瓿管是否熔封严密？若管口尚未封严，将会产生什么不良后果？

（3）液氮超低温冷冻保藏法中，为何缓慢冷冻（控速冷冻）细胞？

附文

1.纯种制曲保藏法

这是根据我国传统制曲经验改进以后的方法，适宜于保藏产生大量孢子的各种霉菌和某些放线菌。

2.甘油保藏法

将20%（也可以用10%）的甘油放入指形管，消毒。敲菌体于其内，-70℃～-20℃保存。

3.几种保藏方法比较

几种微生物保藏方法的比较见表1-19。

表1-19　微生物菌种保藏方法的比较