微生物菌种冷冻真空干燥保藏法环境工程微生物学实验

冷冻真空干燥保藏法是目前最有效的菌种保藏方法之一。此法的优点如下：一是适用范围广泛。除了不宜保藏少数不生孢子只产生菌丝体的丝状真菌外，其他各类微生物——细菌、放线菌、酵母菌、丝状真菌及病毒均可采用此法保藏。二是保藏时间可长达1～20年之久，且保种存活率高、变异率低。此法缺点是，需要冰冻干燥设备且设备昂贵，操作较复杂。

一、实验目的

（1）了解微生物菌种冷冻真空干燥保藏法的基本原理。

（2）掌握冷冻真空干燥保藏法的操作技术。

二、基本原理

冷冻真空干燥保藏法集中菌种保藏的多个有利条件于一身，比如低温、缺氧、干燥和添加保护剂。此法主要包括3个步骤：①将待保藏菌种的细胞或孢子悬浮于保护剂（如脱脂牛奶）中，减少冷冻或水分升华对微生物细胞造成的损害。②在低温下（-70℃左右）使微生物细胞快速冷冻。③在真空下使冰升华，以除去部分水分。

三、实验器材

（1）菌种：准备保藏的细菌、放线菌、酵母菌或霉菌。

（2）培养基：适于培养待保藏菌种的各种斜面培养基。

（3）试剂：脱脂牛奶、2%盐酸等。

（4）器皿：安瓿管、长颈滴管、青霉素小瓶、无菌移液管、冷冻干燥装置。

四、实验步骤

（一）冷冻真空干燥保藏

1.准备安瓿管

安瓿管一般用中性硬质玻璃制成，管内径6～8 mm，长约100 mm。安瓿管先用2%盐酸浸泡过夜，再用自来水冲洗至中性，之后用蒸馏水冲洗3次，最后烘干备用。将印有菌名和接种日期的标签纸置于安瓿管内，有字一面朝向管壁。管口塞上棉花塞并包上牛皮纸，高压蒸汽灭菌（0.1 MPa压力下灭菌30 min）。

2.制备菌悬液

（1）菌种斜面培养：一般利用最适培养基在最适温度下培养菌种斜面，以便获得生长良好的培养物（一般为静止期细胞）。芽孢细菌可以保藏芽孢，放线菌和霉菌可保藏孢子。不同菌种所需的斜面培养时间各不相同，细菌培养24～48 h，酵母菌培养3 d左右，放线菌和霉菌培养7～10 d。

（2）制备菌悬液：吸取2 mL已灭菌的脱脂牛奶至培养好的新鲜菌种斜面中，用接种环轻轻刮下培养物，使其悬浮在牛奶中，制成的菌悬液浓度以108～1010个/毫升为宜。

（3）分装菌悬液：用无菌长滴管吸取0.2 mL菌悬液，滴加在安瓿管底部，注意不要使菌悬液粘在管壁上。

3.冷冻真空干燥的步骤

（1）菌悬液预冻：将装有菌悬液的安瓿管直接放在低温冰箱中（-35℃～-45℃）或放在干冰无水乙醇浴中进行预冻。预冻的目的是使菌悬液在低温条件下冻结成冰（注意预冻温度不要高于-25℃，因为含有脱脂牛奶的菌悬液冰点下降）。

（2）冷冻真空干燥：将装有已冻结菌悬液的安瓿管置于真空干燥箱中，开动真空泵进行真空干燥。在此条件下，菌悬液保持冻结状态并逐渐升华。继续抽气，当真空度达到0.066 7 MPa后，维持6～8 h，样品即被干燥，干燥样品呈白色疏松状态。若采用简易冷冻真空干燥装置，应在开动真空泵后15 min内，使真空度达到0.066 7 MPa。

（3）安瓿管封口：样品干燥后，先用火焰将安瓿管棉塞下端处烧熔并拉成细颈，再将安瓿管接在封口用的抽气装置上，开动真空泵，室温抽气。当真空度达到0.026 87 MPa时，继续抽气数分钟，再用火焰在细颈处烧熔封口。(www.xing528.com)

（4）保藏：将封口带菌安瓿管置于冰箱（5℃左右）中或室温下避光保存。

（二）简易冷冻真空干燥保藏

简易冷冻真空干燥保藏法的优点如下：可用生化实验室中常用的普通冷冻干燥装置代替微生物实验室中专用的冷冻真空干燥装置，并可用无菌容器封口膜覆盖的药用青霉素小瓶代替无菌熔封安瓿管，进行菌种的冷冻真空干燥保藏。

1.制备无菌瓶

将药用青霉素小瓶先用2%盐酸浸泡8～10 h，再用自来水冲洗3次，之后用蒸馏水洗1～2次，最后烘干。将印有菌种和接种日期的标签纸置于小瓶中，瓶口用无菌容器封口膜覆盖扎紧，连同小瓶的橡皮塞一起高压蒸汽灭菌（0.1 MPa压力下灭菌20 min），备用。

2.制备无菌脱脂牛奶

制备脱脂牛奶或配制40%脱脂奶粉，在0.08 MPa压力下灭菌20 min，并进行无菌检查。

3.制备菌悬液

在培养好的新鲜菌种斜面上，加入3 mL无菌水，用接种环刮下菌苔（注意不要刮破培养基），轻轻搅动，制成菌悬液。

4.分装

用无菌移液管将菌悬液分装至灭过菌的青霉素小瓶中，每瓶装0.2 mL，再用无菌长滴管将灭过菌的0.2 mL脱脂牛奶加入青霉素小瓶中，振摇混匀。

5.预冻

将青霉素小瓶放入500 mL干燥瓶中，放入-40℃～-35℃低温冰箱中保存20 min，待小瓶中菌悬液冻结成固体后取出。

6.冷冻真空干燥

迅速将干燥瓶插在冷冻干燥器的抽真空插管上，抽真空冷冻干燥24～36 h，待菌体混合物呈疏松状态（稍一振动即脱离瓶壁）时方可取出。

7.封存

在无菌室内将无菌容器封口膜取下，迅速更换无菌橡皮塞，最后用封口膜将瓶口封住，置于-20℃低温冰箱保存。

五、注意事项

冷冻真空干燥时，应将菌体混合物充分干燥，使之呈疏松状态。

六、思考题

在冷冻干燥保藏中，需要先将菌悬液预冻，再进行真空干燥，这样做的原因是什么？