微生物菌种保藏实验成果

通过选种育种获得的优良菌种，在生产和保藏过程中，还会不断地产生变异，甚至衰退。菌种保藏的任务就是在广泛收集具有优良特性的生产和科研菌种基础上，将它们妥善保管。菌种保藏后要求不死和不发生变异，菌种优良性状不衰退丧失。

常用的菌种简易保藏方法有斜面低温保藏法、半固体穿刺保藏法、液体石蜡封藏法、沙土管保藏法等。由于这些保藏方法不需要特殊实验设备，操作简便，为一般实验室广泛采用。在实际工作和生产中究竟用哪种方法保藏菌种，需要根据设备和菌种的具体情况决定。

一、实验目的

（1）学习了解几种常用的菌种简易的微生物菌种保藏的原理和方法。

（2）掌握几种常用的菌种简易保藏技术。

二、菌种保藏的原理

菌种保藏主要是根据微生物的生理、生化特点，人为地创造一种微环境，使微生物菌种的代谢活动处于最低水平和生长、繁殖受抑制的休眠状态。微生物菌种长期处在这种极端条件下，很少会发生变异，达到保持其纯而不死、不变异、不被杂菌污染、壮而不衰。菌种保藏须遵循的原则如下：①选用典型的纯培养物，最好采用休眠体（如细菌的芽孢、放线菌和真菌的孢子等）进行保藏。②营造有利于菌种休眠的环境；如低温、干燥、无氧、避光、缺乏营养以及添加保护剂或中和剂等，可进行较长时期的保藏。③尽量减少传代次数。

斜面低温保藏法（图1-46）和半固体穿刺保藏法（图1-47）是将在斜面或半固体培养基上长好的培养物置于4℃～5℃冰箱中保藏，并定期移植。这两种方法都是利用低温抑制微生物的生长繁殖，延长保藏时间。

液体石蜡封藏法（图1-48）是在新鲜的斜面培养物上，覆盖一层已灭菌的液体石蜡，再置于4℃～5℃冰箱中保藏。液体石蜡主要起隔绝空气的作用，使培养物不与空气直接接触，降低对微生物的供氧量，阻碍需氧菌种生长。液体石蜡也起着减少培养基水分蒸发的作用。这种方法利用缺氧和低温抑制微生物生长繁殖，以延长保藏时间。

沙土管保藏法（图1-49）：将待保藏的菌种接种于适当的斜面上，培养后制成孢子悬液；再通过无菌操作将孢子悬液滴入已灭菌的沙土管中，使孢子被吸附在沙子上；之后将沙土管置于真空干燥器中，抽真空吸干沙土管中水分，最后将干燥器置于4℃冰箱中保藏。此法是利用干燥、缺氧、缺营养和低温等因素综合抑制微生物生长繁殖，达到延长保藏时间的目的。

图1-46　斜面低温保藏法

图1-47　半固体穿刺保藏法

图1-48　液体石蜡保藏法

图1-49　沙土管保藏法

三、实验器材

（1）菌种：准备保藏的细菌、放线菌、酵母菌和霉菌。

（2）培养基：牛肉膏蛋白胨斜面培养基、牛肉膏蛋白胨半固体深层培养基、豆芽汁葡萄糖斜面培养基、高氏一号斜面培养基、LB（Luria broth）培养基。

（3）其他用品：接种环、接种针、无菌滴管、无菌液体石蜡、无菌甘油、五氧化二磷或无水氯化钙、黄土、河沙等。

四、实验步骤

（一）斜面低温保藏法

这是实验室最常用、最基本的一种菌种保藏方法，适用范围较广，主要用于保藏细菌、放线菌、酵母菌和霉菌。

1.接种

将不同菌种划线接种在斜面培养基上。

2.培养

在适宜的温度下培养，待菌种生长丰满（也有建议稍微生长即可）。若是生芽孢的细菌或生孢子的放线菌和霉菌，则要等到芽孢或孢子长成后再进行保存。

3.保藏

将培养好的菌种置4℃～5℃的冰箱中保藏。

4.转接

不同菌种的有效保藏期不等，因而每隔一定时间，一般3～6个月，需重新移植到新鲜斜面培养基上适当培养后再保藏，如此连续不断。

这种方法操作简单，不需要特殊设备，存菌率高，具有一定的保藏效果；但保藏时间较短，菌种反复转接易发生变异，生理活性易发生减退。

（二）半固体穿刺保藏法

这种方法一般用于保藏兼性厌氧细菌或酵母菌。此法与斜面保藏法大同小异，仅将斜面改为直立柱，培养基中琼脂量减少。

1.接种

方法为穿刺接种法，用接种针将菌种穿刺接种至半固体培养基深层中央部分，注意切勿穿透培养基底面。

2.培养

在适宜温度条件下培养至生长充分。

3.保藏

待菌在穿刺线上长成后置4℃～5℃的冰箱中保藏。也可加无菌液体石蜡（150℃～170℃烘箱灭菌1 h）覆盖，即配合使用石蜡油封保藏法，抑制生物代谢，推迟细胞老化，防止培养基水分蒸发，因而能延长菌种的保藏时间。如果用无菌橡皮塞，则保存效果更好。(www.xing528.com)

4.转接

一般在保藏半年或一年后，需转接至新配制的半固体培养基培养后再保藏。

（三）液体石蜡封藏法

液体石蜡封藏法适用于保藏霉菌、酵母菌和放线菌，保藏时间可长达1～2年，并且操作简便，但不适于细菌和某些霉菌（如固氮菌、乳杆菌、分枝杆菌和毛霉、根霉等）的保藏。

1.液体石蜡灭菌

将液体石蜡置于100 mL的锥形瓶内，每瓶装10 mL，塞上棉塞，外包牛皮纸，高压蒸汽灭菌（0.1 MPa灭菌30 min）。灭菌后将装有液体石蜡的锥形瓶置于105℃～110℃的烘箱内约1 h，以除去液体石蜡中的水分。

2.接种

将菌种接种到适宜的斜面培养基上。

3.培养

在适宜的温度下培养，使其充分生长。

4.加液体石蜡

用无菌吸管吸取已灭菌的液体石蜡，注入已长好菌苔的斜面上。液体石蜡的用量以高出斜面顶端1 cm左右为宜，保证菌种与空气隔绝。

5.保藏

将加入液体石蜡的斜面培养基直立置于4℃～5℃冰箱中或室温下保藏。

6.转接

到保藏有效期（1～2年）后，需将菌种转接到新配制的斜面培养基上，培养好后加入适量液体石蜡，再进行保藏。

（四）沙土管保藏法

土壤是自然界各类菌种的栖居场所，对微生物起保护作用，可提高微生物的存活率。沙土管保藏法就是在此基础上发展起来的。由于其制作简单，保藏期长，使用方便，特别适用于产芽孢或孢子的微生物，常用于细菌芽孢、霉菌和放线菌孢子的保藏。一般可保藏3年左右。但不适用于保藏无芽孢细菌和酵母菌。

1.无菌沙土管制备

（1）河沙处理。取河沙适量，用40目筛子过筛，除去大颗粒，再用10%盐酸浸泡2～4 h（盐酸应浸没沙面）；之后除去有机杂质，倾去盐酸，用自来水冲洗至中性，烘干。

（2）筛土。取非耕作层的瘦黄土适量，磨细，用100目筛子过筛。

（3）沙和土混合。取1份土加4份沙混合均匀，装入如血清管大小的试管中。装量约1 cm，塞上棉塞。

（4）灭菌。高压（0.1 MPa）蒸汽灭菌1 h。每天1次，连续灭菌3 d。

（5）无菌检查。取灭菌后的沙土少许，接入牛肉膏蛋白胨培养液中，30℃培养1～2 d，观察有无杂菌生长。若有，需再次重复灭菌。

2.制备菌悬液

吸取3～5 mL无菌水注入1支已培养好待保藏的菌种斜面中，用接种环轻轻搅动培养物，使其呈悬浮状，制成菌悬液。

3.加样

用无菌吸管吸取菌悬液，在每支沙土管中滴加4～5滴，用接种环搅匀，沙土管口塞上棉塞。

4.干燥

将滴加菌悬液的沙土管置于干燥器内。事先应在干燥器内放五氧化二磷或无水氯化钙作为干燥剂，吸收水分。待干燥器内干燥剂因吸水变成糊状时，需及时更换。反复数次，保持沙土管干燥。也可用真空泵连续抽气约3 h，干燥效果更佳。

5.抽样检查

从干燥的沙土管中，每10支抽1支进行检查。用接种环取少许沙土，接种到适于所保藏菌种生长的斜面上培养，检查有无杂菌生长及所保藏菌种的生长情况。

6.保藏

若检查没有发现任何问题，可选用以下任一方式保藏。

（1）沙土管继续放在干燥器内，将干燥器置于室温或冰箱中。

（2）将沙土管带塞一端浸入熔化的石蜡中，密封管口。

（3）用酒精喷灯将沙土管棉塞以下的玻璃烧熔，封住管口，然后放于冰箱保藏。

五、思考题

（1）实验室中，细菌、霉菌、酵母菌和放线菌菌种常用哪种方法保藏？

（2）沙土管保藏法适于保藏哪种类型的微生物？灭菌后的沙土管为何必须进行无菌检查？