一、实验目的
（1）学习分离与纯化噬菌体的基本原理和方法。
（2）掌握噬菌体的特性，观察噬菌体的形态结构。
（3）熟悉双层琼脂法的操作技术。
（4）掌握噬菌体的效价测定方法。
二、实验原理
噬菌体是细菌病毒，营专性寄生生活。病毒的分离纯化只能利用病毒与其寄主的实验性感染。噬菌体在自然界中广泛存在，有宿主的地方，一般都能发现其噬菌体。
利用噬菌体对宿主细胞的专一性培养分离，利用烈性噬菌体使宿主裂解形成肉眼可见的噬菌斑计数。噬菌体的分离纯化常用双层琼脂法。在含有敏感菌株——宿主的平板上，一般一个噬菌体只产生一个噬菌斑，据噬菌斑的数量可以推算出单位容积（比如毫升）培养液中噬菌体的数量，这个量即噬菌体的效价。
本实验以从阴沟污水中分离大肠杆菌噬菌体为例。
三、实验仪器与材料
1.仪器与器皿
实验所需仪器与器皿有离心机、分光光度计、显微镜、恒温培养箱、真空泵、恒温水浴箱、摇床、移液管、培养皿、抽滤瓶、三角刮刀、接种针、锥形瓶、蔡氏细菌滤器、试管等。
2.菌种
用4 mL生理盐水将在37℃、培养18～24 h的大肠杆菌斜面菌苔洗下，制成大肠杆菌悬液。
3.培养基
（1）3倍浓缩的肉膏蛋白胨液体培养基（50毫升/瓶）。
（2）上层肉膏蛋白胨培养基：含琼脂0.6%（6 g/L），用试管分装，每管4 mL。
（3）下层肉膏蛋白胨培养基：含琼脂1.5%～2.0%（15～20 g/L），倒平板，每皿约10 mL。
4.样品
实验所需样品为含大肠杆菌噬菌体的阴沟污水。
四、实验步骤
（一）噬菌体的分离
1.噬菌体增殖
自大肠杆菌培养斜面用接种环接种3环菌于盛有100 mL三倍浓缩的肉膏蛋白胨液体培养基的锥形瓶内，再取200 mL污水及2 mL大肠杆菌菌悬液加入锥形瓶，于37℃振荡培养12～24 h。
2.制备噬菌体裂解液
将上述培养液以4 000 r/min离心15 min，上清液用蔡氏细菌滤器过滤除菌，以除去未被裂解的大肠杆菌及其他杂菌。滤液倒入另一无菌锥形瓶中。置37℃培养过夜，以进行无菌检查。
3.分离噬菌体，验证其存在
次日，上述滤液若无菌生长，可进行噬菌体存在实验。方法有试管法和琼脂平板法，本实验采用琼脂平板法。(www.xing528.com)
（1）于底层肉膏琼脂平板上滴加大肠杆菌菌液一滴，用无菌三角刮刀涂匀成一薄层。
（2）待菌液干后滴加上述滤液3～5小滴分点布于平板上，注意每小滴量不能多，以免流淌。另设一只加菌液而不加滤液的平板做对照。
（3）将两平板倒置于37℃培养过夜。
（4）若平板上加滤液处发现呈吞食状噬菌斑，那么滤液中有大肠杆菌噬菌体的存在。
（5）噬菌体增殖：将已证明有噬菌体存在的滤液接种于原已同时接种大肠杆菌的肉汤内。如此重复移种数次，即可使噬菌体增多。
（二）噬菌体的纯化
如上面分离出的噬菌体往往不纯，噬菌斑的形态、大小不一致，还需要进行噬菌体的纯化。
1.滤液稀释
将含有大肠杆菌噬菌体的滤液用肉膏蛋白胨培养液按10倍稀释法依次稀释为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5 5个稀释度。
2.倒下层平板
取9 cm直径的平皿5个，每皿约倒10 mL下层肉膏蛋白胨培养基，依次标明10-1、10-2、10-3、10-4、10-5 5个稀释度。
3.倒上层平板
取5支各装有4 mL上层琼脂培养基的试管，依次标明10-1、10-2、10-3、10-4、10-5 5个稀释度，融化后置于50℃左右的恒温水浴箱内保温。分别向每支试管加0.1 mL大肠杆菌菌液，再对号加入0.1 mL各稀释度的滤液，摇匀；之后对号倒入下层肉膏琼脂培养基平板上，摇匀铺平。
4.培养
待上层肉膏蛋白胨培养基凝固后将平板倒置于37℃恒温培养箱培养18～24 h，然后可观察到形成的噬菌斑。分别记录下噬菌斑的数量。
5.分离纯化
用接种针在出现单个噬菌斑的平板上刺几下，接种于含有大肠杆菌的肉膏培养液中，37℃培养18～24 h，再按上述方法进行稀释（3～5次），倒平板分离、纯化，直到平板上出现形态和大小一致的噬菌斑，表示已获得纯的大肠杆菌噬菌体。
五、实验报告
（1）描述分离得到的噬菌斑大小、形态等特征。
（2）记录下将平板上出现的噬菌斑数量（表1-18）。
表1-18 噬菌斑数量统计表
（3）计算噬菌体的效价：活噬菌体数（mL）=噬菌斑数×噬菌体稀释度×10。
六、思考题
（1）实验中得到的噬菌斑与细菌菌落有哪些不同？
（2）以同一敏感菌株为宿主分离得到的噬菌体往往有“不纯”现象，为什么？
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