环境工程微生物学实验：厌氧菌的纯种分离与培养

一、实验目的

（1）学会厌氧菌的接种、分离、培养技术。

（2）学会厌氧菌的保藏技术。

二、实验原理

产甲烷菌是典型的厌氧菌。厌氧菌的分离培养技术，一是富集培养，二是采用亨盖特（Hungate）技术进行纯培养的分离。将接种物置于装有培养基的200 mL培养瓶中，在旋转摇床上边振动边通入氢气与二氧化碳的混合气体[V（氢气）∶V（二氧化碳）=80∶20]，培养一定时间后可直接划线培养或稀释后在琼脂滚筒内划线。

三、实验仪器

实验仪器包括高压蒸汽灭菌器、摇床、净化工作台、充气机、各种玻璃器皿、试管、圆底烧瓶、注射器等。

四、实验试剂

实验试剂包括葡萄糖、牛肉膏、蛋白胨、半胱氨酸、氯化钠、刃天青、乳酸钠、酵母膏、氯化铵、氯化镁、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、甲醇、四水合氯化铁、六水合氯化钴、氯化锌、氯化钙、七水合硫酸镁、硼酸、钼酸钠、硫酸铝钾、四水合氯化锰、琥珀酸钠、硫酸铵、氯化铁。

五、实验操作

1.采样方法

（1）采用生态分布采样法，取样深度、体积要基本一致，尽量减少差异。

（2）如在不同地点采集污泥沉积物，则应除去地表面的泥层，将底层呈现乌黑色的沉积物，放入带塞的无菌广口瓶中。

（3）采集废水处理流出样，待流出样处于稳定状态时即可采样。

（4）无论采集哪一种样品，采样后都应该即时封闭瓶口迅速带回实验室接种，尽量减少样品与空气的接触。

2.培养基的配制

（1）培养基配方如下：葡萄糖0.5 g、磷酸二氢钾0.4 g、蛋白胨1 g、硫酸铵0.5 g、酵母膏1 g、氯化铁0.01 g、氯化钙0.1 g、七水合硫酸镁0.05 g、氯化镁0.1 g、原污水250 mL、蒸馏水750 mL、琼脂15 g，调整pH为7.2～7.4，121℃、高压蒸汽灭菌30 min。

（2）培养基配制方法：取一500 mL圆底烧瓶，内装200 mL水，按比例加入培养基成分。将18号针头弯曲，针尖锉平，制成一个打气探针。取一个5 mL注射器，取下活塞针，筒内用棉花填充，将针头和注射器连接在一起，灭菌处理。灭菌后用胶管连接，输入V（氢气）∶V（二氧化碳）=80∶20的混合气体。气体注入前先通过350℃灼热铜柱，以便除去气体中的微量氧气。培养基制备流程见图1-42所示。

图1-42　培养基制备流程图

处理的混合气体通入烧瓶，排出空气。当培养基完全还原时，方可移入试管。

将培养基移入试管的方法：移入吸管必须先用培养基上面的气体冲洗，填充，然后插入培养基的底部。这样，培养基移入试管时就处于无氧气体层的下面。将另一针头置于直立试管内不断进气，使培养基在移入时仍处于无氧状态。这样一边进气，一边用吸管移入培养基。在灭菌时试管口的橡皮塞必须夹紧或用线绕好。(www.xing528.com)

3.接种技术及操作步骤

滚管技术即亨盖特（Hungate）分离技术，如图1-43所示。

图1-43　培养严格厌氧细菌的亨盖特分离技术示意图

（1）将带有培养基的试管在水龙头下的冷水中不断转动，冷却成为固体培养基。

（2）琼脂围绕管壁完全凝固后（有少量水分集中在底部），可放置贮存待用。

（3）滚管灭菌时，橡皮塞要在火焰上灼烧片刻，再捏住塞子的末端转动瓶口。取下瓶塞之前针筒打气探针要对着喷灯火焰。

（4）当喷出气流对准火焰，气流使火炮形状处于稳定状态时，探针针头迅速通过火焰灭菌。

（5）皮塞取下时，将灭菌的打气探针迅速插入管内。

（6）用同步电动机带动试管划线器，60 r/min。

图1-44　亨盖特分离技术的滚管划线装置

（7）当试管在同步电动机上旋转时，接种环上的接种物一定要越过打气针伸到管底。

（8）接种针轻轻靠近琼脂表面，沿着同一方向轻轻划动（图1-44）。此操作完成以后捏住棉皮塞的一端在火焰上灼烧一下，挨着打气针塞住管口，迅速拔下针头（操作应在无菌室进行，见图1-45），旋紧管塞。

图1-45　划线接种培养后，在管壁培养基上菌落的生长情况

（9）划线后的试管，直立保温，置于生化恒温箱内，37℃塔养48～72 h；若要长期保藏，保藏温度为-70℃。

（10）使用的混合气体的比例为V（氢气）∶V（二氧化碳）=80∶20或10∶80。

六、思考题

阐述产甲烷菌分离纯化的一般步骤。