环境工程微生物学实验：细菌纯种分离、穿刺接种培养法

一、实验目的

（1）学会穿刺接种培养技术。

（2）学会观察分析细菌的运动状态、呼吸类型。

（3）学会一种细菌的分类鉴定实验方法。

二、实验原理

穿刺接种技术是一种用接种针从菌种斜面上跳取少量菌体并把它穿刺到明胶培养基、固体或半固体深层培养基中的接种方法。穿刺接种法常用于细菌运动能力的检查、细菌呼吸类型的分析、菌种保藏等。

用穿刺接种法将某些种类的细菌接种在明胶培养基中培养，能产生明胶水解酶水解明胶，不同的细菌将明胶水解成不同形态的溶菌区（图1-39）。依据这些不同形态的溶菌区或溶菌与否可将细菌进行分类。

用穿刺接技术将细菌接种在半固体培养基中培养，细菌可呈现各种生长状态（图1-40）。根据细菌的生长状态判断细菌的呼吸类型、有无鞭毛，能否运动。

图1-39　细菌在明胶穿刺培养基中的生长状态

A.火山口状；B.芜菁状；C.漏斗状D.囊状；E.层状

图1-40　细菌在半固体培养基中的生长特征

A.丝状；B.念珠状；C.乳头状D.绒毛状；E.树状

细菌呼吸类型判断：在培养基表面生长的细菌为好氧菌；在穿刺线上部生长的细菌为好氧和微量好氧菌；沿整条穿刺线生长的细菌为兼性厌氧菌或兼性好氧菌；在穿刺线下部生长的细菌为厌氧菌。

运动状态判断：只能在穿刺线上生长的细菌无鞭毛、不能运动；不但沿穿刺线生长而且在穿刺线的周围扩散生长的细菌有鞭毛、能运动。

三、实验仪器和材料

（1）高压蒸汽灭菌器、生化恒温培养箱。(www.xing528.com)

（2）玻璃器皿：250 mL三角瓶、16 cm试管、500 mL烧杯、玻璃棒等。

（3）斜面培养基培养的菌种。

（4）试剂：牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、氢氧化钠、琼脂、pH试纸、蒸馏水（或无菌水）等。

（5）其他：接种针、天平、药匙、纱布、脱脂棉、牛皮纸、橡皮筋、酒精灯、试管架等。

四、实验步骤

（1）手持试管。

（2）旋松棉塞（试管盖）。

（3）右手拿接种针在火焰上将针端灼烧灭菌，然后把在穿刺中可能伸入试管的其他部位也灼烧灭菌。

（4）用右手的小指、无名指和手掌边拔出棉塞（试管盖）。接种针先在培养基部分冷却，再用接种针针尖蘸取少量菌种。

（5）接种有两种手持操作法。一种是水平法，类似于斜面接种法；另一种称为垂直法。尽管穿刺时手持方法不同，但穿刺时所用接种针都必须挺直，将接种针自培养基中心垂直地刺入培养基中。穿刺时要做到手稳，动作轻巧快速，并要将接种针穿刺到接近试管底部，然后沿着接种线将针拔出。之后插回棉塞（试管盖）。最后将接种针在火焰上灼烧灭菌（图1-41）。

（6）将接种过的试管直立于试管架上，置于37℃生化恒温培养箱中培养24～48 h。

（7）观察结果。

图1-41　穿刺接种技术示意图

五、思考题

如何判断细菌的呼吸类型和运动能力？