环境工程微生物学实验：细菌纯种分离与培养方法

一、实验目的

通过实验掌握平板表面涂布分离技术。

二、实验原理

平板表面涂布法同浇注平板法、平板划线法的实验原理类似，把混杂在一起的微生物高度分散在培养基表面，使单个微生物细胞在固体培养基上生长而形成单个菌落。不过，该法加样量不宜过多，只能0.5 mL以下，一般0.2 mL为宜。培养起初不能倒置，正放一段时间待水分蒸发后再倒置培养。

三、实验仪器和材料

（1）高压蒸汽灭菌器、生化恒温培养箱。

（2）玻璃器皿：250 mL三角瓶、16 cm试管、500 mL烧杯、移液管（1 mL、10 mL）、培养皿、玻璃棒等。

（3）斜面培养基培养的菌种或废水、活性污泥、土壤悬液、湖水或河水1瓶。

（4）试剂：牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、氢氧化钠、琼脂、pH试纸、蒸馏水（或无菌水）等。

（5）其他：三角刮刀或刮刀、天平、药匙、纱布、脱脂棉、牛皮纸、橡皮筋、酒精灯等。

四、实验步骤

1.稀释样品

样品稀释参考浇注平板法中水样稀释方法。

2.牛肉膏蛋白胨培养基的制备

用天平分别称量：牛肉膏0.75 g、蛋白胨2.5 g、氯化钠1.25 g、琼脂2.5～5 g、蒸馏水250 mL（有时也可用自来水），依次加入烧杯中，混合后在电炉上加热，不断搅拌以免糊底，直至完全溶解。过滤去除沉淀，加水补足因加热蒸发的水量，用氢氧化钠溶液或盐酸调pH至7～8，倒入三角烧瓶中。120℃灭菌15～30 min，待用。(www.xing528.com)

3.制作平板

将已灭菌冷却至45℃左右的培养基倒入培养皿至皿高的1/3（在无菌工作台内或无菌室内操作），凝固成平板。

4.涂布

（1）用无菌移液管吸取适量已稀释的样品于平板上。

（2）再用无菌三角刮刀在平板上轻轻涂抹均匀（图1-36）。注意：涂抹时切勿弄破平板，影响菌落生长；在酒精灯火焰附近操作。

5.培养

先在37℃恒温箱正置培养，待水分蒸发后倒置培养；若培养时间较长，次日把培养皿倒置继续培养，培养时间总长24～48 h。

6.观察结果

培养结束后观察、分析菌落情况。

图1-36　平板涂布法

五、思考题

（1）为什么要先正置后倒置培养？

（2）试比较平板表面涂布法与浇注平板法、平板划线法接种方式、菌落分布的不同。