实验环境工程微生物学实验

一、实验目的

掌握划线平板分离技术。

二、实验原理

平板划线法应用最为普遍，因为平板划线可以将斜面培养的菌落或将废水、活性污泥、湖水、河水等水样进一步纯化。据平板划线得到的菌落可以观察是否有不同形态的菌落，判断细菌的纯化程度。

三、实验器材

（1）高压蒸汽灭菌器、生化恒温培养箱。

（2）玻璃器皿：250 mL三角瓶、16 cm试管、500 mL烧杯、移液管（1 mL、10 mL）、培养皿、玻璃棒等。

（3）斜面培养基培养的菌种或废水、活性污泥、土壤悬液、湖水或河水1瓶。

（4）试剂：牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、氢氧化钠、琼脂、pH试纸、蒸馏水（或无菌水）等。

（5）其他：接种针（环）、天平、药匙、纱布、脱脂棉、牛皮纸、橡皮筋、酒精灯等。

四、实验步骤

1.牛肉膏蛋白胨培养基的制备

用天平分别称量：牛肉膏0.75 g、蛋白胨2.5 g、氯化钠1.25 g、琼脂2.5～5 g、蒸馏水250 mL（有时也可用自来水），依次加入烧杯中，混合后在电炉上加热，不断搅拌以免糊底，直至完全溶解。过滤去除沉淀，加水补足因加热蒸发的水量，用氢氧化钠或盐酸调pH至7～8，倒入三角烧瓶中。120℃灭菌15～30 min，待用。

2.制作平板

将已灭菌冷却至45℃左右的培养基倒入培养皿至皿高的1/3（在无菌工作台内或无菌室内操作），凝固成平板。

3.划线(www.xing528.com)

（1）用酒精将接种针（环）灭菌。

（2）用接种针从斜面上或挑取少量生长的菌种；或用接种环挑取一环活性污泥（或废水、土壤悬液、湖水等其他样品）。

（3）左手拿培养皿，中指、无名指和小指手托住皿底，拇指和食指夹住皿盖，将培养皿稍倾斜，左手拇指和食指将皿盖掀半开，右手持接种针（环）伸入培养皿内，在平板上轻轻划线（切勿破坏培养基，又能充分分散细胞以获得单菌落），划线的方式可取图1-34中任何一种，划线完毕盖好皿盖。

图1-34　平板划线法示意图

A.操作示意；B.平板分区；5区法；C.平板分区3区法

（4）倒置37℃恒温箱培养24～48 h。

（5）观察结果。

（6）培养后获得单菌落，可再将单菌落转移至斜面上（图1-35）。

（7）如此反复3～4次获得纯化菌株，此菌株可进行细菌种属鉴定。

图1-35　斜面接种示意图

五、思考题

（1）为什么要将培养基冷至45℃左右再倒平板？

（2）试述细菌划线法的优缺点。