环境工程微生物学实验：细菌分离、培养方法

一、实验目的

（1）通过实验掌握从各种环境（土壤、水体、活性污泥、垃圾、堆肥）中分离、稀释、浇注平板接种、培养微生物的方法。

（2）掌握稀释水样的方法。

（3）通过实验学会得到单一菌落的纯化分离方法。

二、实验原理

自然界中各种微生物混杂并存。我们在研究某种微生物时，必须先将它从混杂微生物中分离出来。稀释水样是为了降低水样中混杂生存的微生物浓度以便于分离。该实验的基本原理在于高度分散混菌，使单个微生物细胞在固体培养基上生长而形成单个菌落。

三、实验器材

（1）高压蒸汽灭菌器、生化恒温培养箱。

（2）玻璃器皿：250 mL三角瓶、16 cm试管、500 mL烧杯、移液管（1 mL、10 mL）、培养皿、玻璃棒等。

（3）废水、活性污泥、土壤悬液、湖水或河水1瓶。

（4）试剂：牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、氢氧化钠、琼脂、pH试纸、蒸馏水（或无菌水）等。

（5）其他：天平、药匙、纱布、脱脂棉、牛皮纸、橡皮筋、酒精灯等。

四、实验步骤

1.牛肉膏蛋白胨培养基的制备

用天平分别称量牛肉膏0.75 g、蛋白胨2.5 g、氯化钠1.25 g、琼脂2.5～5 g，取蒸馏水250 mL（有时也可用自来水），依次加入烧杯中，混合后在电炉上加热，不断搅拌以免糊底，直至完全溶解。过滤去除沉淀，加水补足因加热蒸发的水量，倒入三角烧瓶中。120℃灭菌15～30 min，待用。

2.稀释水样

先用镊子取出一块酒精棉球擦手、镊子以及工作台，点燃酒精灯。(www.xing528.com)

将一瓶90 mL和数管（管数据实验数据而定，本次实验设5管）9 mL的无菌水排列好，按10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6依次编号。在无菌条件下，用10 mL的无菌移液管吸取10 mL水样或活性污泥（或其他样品10 g）置于第一瓶90 mL无菌水（内含玻璃珠）中，用移液管吹洗3次，手摇10 min（或用混合器）将颗粒状样品打散，即为10-1浓度的混合液。用1 mL无菌移液管吸取1 mL的10-1浓度的菌液于一管9 mL无菌水中，用移液管吹洗3次，摇匀后即为10-2浓度的菌液。同法依次稀释到10-6。稀释过程如图1-32所示。

图1-32　样品稀释过程

3.制作平板

（1）培养皿编号：取已灭菌的培养皿10套分别编号，10-4、10-5、10-6稀释度的菌液各3套，空气对照1套。

（2）加水样：取1支1 mL无菌移液管从稀释度小的10-6菌液开始，以10-6、10-5、10-4稀释度为序，分别吸取1 mL（或0.5 mL）菌液于相应编号的培养皿内（注：每次吸取前，用移液管在菌液中吹吸使菌液充分混匀）。也可以直接用微量移液枪移取菌液，每移一次换一个枪头。移取液体前，用70%乙醇对进入试管的枪体进行擦拭消毒。

（3）倒平板、接种：在酒精火焰附近将已灭菌且冷却至45℃左右的培养基倒入培养皿，10～15 mL/皿，培养基约占皿高的1/3～1/2。具体倒法：右手拿装有培养基的锥形瓶，左手拿培养皿（图1-33 A），以中指、无名指和小指托住皿底，拇指和食指将皿盖掀开，倒入培养基后将培养皿平放在桌上，顺时针和逆时针来回转动培养皿，使培养基和菌液充分混匀，冷凝后即成平板。将试管内培养基倒入培养皿制作平板可按图1-33 B操作。

（4）培养：倒置于37℃恒温箱内培养24～48小时，观察结果。

（5）对照样品倒平板、接种：取“对照”的无菌培养皿，倒平板。待培养基凝固后，打开皿盖10分钟后重新盖上，倒置于37℃恒温培养箱培养24～48小时，观察结果。

图1-33　倒平板示意图

A.从锥形瓶倒入培养皿；B.从试管倒入培养皿

五、思考题

（1）用一根无菌移液管接种几种浓度的水样时，应先从哪个浓度开始？说明原因。

（2）用平板分离纯化菌种时，为何要反复挑取单个菌落置于斜面培养基上培养？