制备普通牛肉膏蛋白胨固体培养基-环境工程微生物学实验

一、实验目的

（1）了解配制微生物培养基的基本原理。

（2）学会玻璃器皿的洗涤和各类物品的包装和灭菌的准备工作。

（3）掌握培养基配制和无菌水制备方法。

二、基本原理

大多数微生物均可用人工方法培养。培养基是根据微生物的营养需要，将水、碳源、氮源、无机盐及各种生长因子等按一定比例人工配制而成的营养基质，调整适宜的pH，高温灭菌后，主要用于微生物的分离、培养、鉴定以及菌种保藏等方面。多数培养基采用一部分天然有机物作为碳源、氮源和生长因子的来源，再适当加入一些化学药品配制，属于半合成培养基，其特点是使用含有丰富营养的天然物质，再补充适量的无机盐，配制方便，又能满足微生物的营养需要，大多数微生物都能在此培养基上生长。

三、实验器材

（1）培养皿、试管、吸管、锥形瓶、吸耳球、烧杯等。

（2）纱布、棉花、报纸、牛皮纸。

（3）pH试纸（6～8.4）、洗液、10%的盐酸、10%氢氧化钠溶液。

（4）牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、琼脂、蒸馏水等。

四、实验内容

（一）玻璃器皿的洗刷与包装

1.洗刷

玻璃器皿在使用前要进行洗刷。培养皿、试管、锥形瓶等可先用去污粉或肥皂洗刷，然后用自来水冲洗。吸管可以用洗液浸泡，再用水清洗。洗刷干净的玻璃器皿可放在烘箱中烘干。

2.包装

（1）一套培养皿由一底一盖组成。按实验所需的套数一起用牛皮纸包装。

（2）吸管应在吸端用铁丝塞入少许棉花，构成1～1.5 cm长的棉塞，以防细菌吸进口中，并避免将口中的细菌吹入管内。棉花要塞的松紧适宜，吸时既能通气又不会使棉花滑入管内。将塞好棉花的吸管尖端放在4～5 cm宽的长纸条的一端，吸管与纸条约成45°，折叠包装纸包住尖端，用左手将吸管压紧，在桌面上向前搓转，纸条即旋转式包在管子外面，余下部分折叠打结。按照实验需要，吸管可单支包装或多支包装，以备灭菌。

培养皿和吸管也有放在特制容器内灭菌的。

（3）棉塞的制作：按试管口或锥形瓶口大小估计用棉量，将棉花铺开，中间厚、周围逐渐变薄，近似正方形。折起铺开的棉花的一角（成五角边形），再将棉花卷成一端粗一端细的棉花卷，之后用纱布包裹棉花卷。这样，棉塞就做好了（图1-24）。

图1-24　棉花塞的制作

（4）试管和锥形瓶等的管口或瓶口均需用棉花堵塞。将棉塞细端塞入试管或锥形瓶的口内，四周应紧贴管壁和瓶口，不留缝隙，以防空气中微生物沿棉塞皱褶进入。棉塞不能过松或过紧，以手提棉塞，管、瓶不掉下为准。棉塞的2/3应在管内或瓶口，上端露出少许，以便拔出。棉塞的大小及形状应如图1-25所示。在制作培养基的过程中，如不小心将棉塞粘上培养基，应用清洁棉花重做。

图1-25　对棉塞的要求

1.正确的式样；2.管内部分太短，外部太松；3.外部过小；4.整个棉塞过松；5.管内部分过紧，外部太松

待灭菌的试管和瓶子的口都要用牛皮纸包装，并用线绳捆扎后存放在铁丝篓内以备灭菌。

（二）培养基的制备

1.步骤

（1）配制溶液。按培养基的配方，称取各种原料。取适量的烧杯盛所需的水量，依次将各种原料加入、溶解。难溶解的原料如蛋白胨、肉膏、琼脂等需加热溶解。当原料全部溶解后应加水补充因蒸发所损失的水量。加热时应不断搅拌以防原料在杯底烧焦。(www.xing528.com)

（2）调整pH。用pH试纸测定培养基溶液的pH，按要求以10%盐酸或10%的氢氧化钠溶液调整到所需的pH。

（3）过滤。用纱布或棉花过滤均可，如培养基的杂质很少，可不过滤。

（4）分装。据不同需要，将培养基分装在试管和锥形瓶内。要使培养基直接流入管内和瓶内，注意不要污染管壁，并避免沾湿棉塞造成污染。

图1-26　分装培养基

试管的分装。取一个玻璃漏斗，装在铁架上；漏斗下连一根橡皮管，橡皮管下端再与另一玻璃管相接，橡皮管的中部加一弹簧夹；松开弹簧夹，使培养基直接流人试管内（图1-26）。

装入试管培养基的量视试管大小及需要而定。若所用试管大小为15 mm×150 mm时，液体培养基宜分装至管高的1/4左右；如果分装固体或半固体培养基，在琼脂完全融化后，应趋热分装，用于制作斜面的固体培养基的分装量一般为管高的1/5（3～4 mL）；半固体培养基分装量宜为管高的1/3左右。培养基分装后，塞好棉塞，用防水纸包扎成捆，贴上标签。

锥形瓶的分装。用于振荡培养微生物时，可在250 mL锥形瓶中加入50 mL液体培养基；若用于制作平板培养基时，可在250 mL锥形瓶中加入150 mL液体培养基。

图1-27　斜面的制作

（5）斜面培养基的制作。将装有琼脂的培养基的试管进行灭菌后，趁热搁置在木条或木棒上，使试管呈适当的斜度（图1-27），待培养基凝固。

2.普通牛肉膏蛋白胨固体培养基

它是一种固体培养基，本实验制备后可供测定细菌总数使用。

此固体培养基成分如下：蛋白胨2.5 g、牛肉膏0.75 g、氯化钠1.25 g、琼脂2.5～5 g，最后加蒸馏水至250 mL。

此固体培养基制法如下：①将上列成分混合后，煮沸到琼脂完全溶解，在加热过程中要不断搅拌；②用蒸馏水补充蒸发损失的水分；③调整溶液的pH为7.4～7.6；④趁热用纱布过滤，并分装在试管中，每管装10～15 mL。如装在锥形瓶则要用250 mL锥形瓶，以每瓶装100 mL左右为宜。管口或瓶口均用棉花塞住；⑤置高压蒸汽灭菌器中，以121℃灭菌20分钟，然后储存在阴暗处备用。

（三）无菌水的制备

在试管或瓶内先盛适量的自来水，使其灭菌后水量恰为9 mL或99 mL，此种适量的水体积可在灭菌器内由实验求得。也可先将管或瓶灭菌，再用灭菌的吸管取灭菌的自来水9 mL或99 mL加入管或瓶中。无菌水常用来稀释水样。

五、思考题

（1）试分析普通牛肉膏蛋白胨培养基中的不同成分的作用。

（2）为何要用棉塞堵管口和瓶口？

（3）在培养基制备的操作过程中应注意些什么问题？为什么？

（4）培养基配制完成后，为什么必须立即灭菌？若不能及时灭菌应如何处理？已灭菌的培养基如何进行无菌检查？

附：培养基的配制注意事项

培养基的质量是微生物试验成功与否的关键因素。适宜的培养基制备方法、贮藏条件和质量控制试验是提供优质培养基的保证。

（1）培养基可按配方制备也可使用按配方生产的符合规定的商品化成品培养基，脱水培养基除附有配方和使用说明外还应注明有效期、贮存条件、适用性试验的质控菌株和用途。配制时应按使用说明上的要求操作，受潮结块的不能使用，以确保培养基的质量符合要求。

（2）配制培养基使用的容器应是玻璃器皿或搪瓷器皿如搪瓷筒、量筒、漏斗、三角烧瓶、刻度吸管、试管、培养皿等。器皿应洗净、用蒸馏水冲净、烘干后方可使用。禁用金属容器如铁、铜、铝容器，避免金属离子与培养基成分结合，生成有害物质，影响细菌生长。

（3）使用蒸馏水完全冲洗玻璃器皿以消除清洁剂和外来物质的残留，并进行清除污物的确认。

（4）配制培养基最常用的溶剂是纯净水，特殊情况下需要用去离子水和蒸馏水，对热敏感的培养基应用灭菌水和无菌容器配制与分装，配制时若需加热助溶应注意温度不要过高。

（5）对配制培养基的过程做详细的记录，记录内容包括配制日期、培养基名称、成分、配制数量、质量监控结果等。