环境工程微生物学实验：微生物的大小与数量测定

一、实验目的

（1）学习测微技术，掌握使用显微测微尺测定微生物（酵母菌）大小的方法。

（2）掌握对不同形态细菌大小测定的分类学基本要求，增强对微生物细胞大小的感性认识。

（3）学习并掌握使用血细胞计数板测定微生物细胞或孢子数量的原理和方法。

二、实验原理

1.微生物大小的测定

微生物的大小是微生物基本的形态特征，也是分类鉴定的依据之一。微生物大小测定需借助具有精密刻度的显微测微尺——目镜测微尺和物镜测微尺（图1-20）来完成。

图1-20　目测微尺和物测微尺示意图

A.目镜测微尺；B.物镜测微尺
1.目镜测微尺；2.物镜测微尺；3.物镜测微尺的中心部放大；4.物镜测微尺标定目镜测微尺时两者的重叠

目镜测微尺是一块可放入目镜内的圆形小玻片，其中央有精确的等分刻度，一般有把5 mm长度等分为50小格和把10 mm长度等分为100小格两种。每小格所代表的实际长度随不同放大倍数的物镜而改变，使用前需用物镜测微尺标定。测量时，需将其放在目镜中的隔板上，用以测量经显微镜放大后的物像。

物镜测微尺（又称台尺、镜台测微尺）是一个特制载玻片，中央刻有1 mm长的标尺。标尺被精确等分为10个大格，每个大格又分为10个小格，共100个小格，每个小格10μm。物镜测微尺并不直接用来测量细胞的大小，而是用于校正目镜测微尺每格的实际长度。

用目镜测微尺测量微生物大小时，必须先用物镜测微尺进行校正，然后根据微生物相当于目镜测微尺的格数计算出实际大小。

2.显微直接计数法

测定微生物细胞数量的方法很多，有分光光度法、显微直接计数法、平板计数法、光电比浊法、最大或然数法（most probable number，MPN）以及膜过滤法（membrane filtration）等。分光光度法比较简便，易操作，但是会使数据严重偏大；而平板计数法则会使实验数据严重偏小。显微计数法适用于各种含单细胞菌体的纯培养悬浮液，但如有杂菌或杂质，常不易分辨。用于微生物直接测数的计数板有细菌计数板和血球计数板（图1-21）两种。两者的构造基本一致，其正面及侧面见图1-22 A与B。细菌计数板和血球计数板的差别在于计数室高度，前者为0.02 mm，一般用于计数细菌等较小的微生物；后者高0.1 mm，一般用于计数菌体较大的酵母菌或霉菌孢子等。细菌计数板较薄，可以使用油镜观察；而血球计数板较厚，不能使用油镜，计数板下部的细菌不易看清。图1-21右图为放大后的计数网格，通常取中央一大格（计数室）进行计数。本实验采用血球计数板法，主要目的是了解血球计数板法的构造和使用方法，学会用血球计数板对酵母菌细胞进行计数。

血球计数板（图1-21）是一块特制的厚型载玻片，载玻片上有4条槽而构成3个平台。中间较宽的平面比其他平面略低，被一短横槽分隔成两半，每个半边上面各有一个刻有9个大方格的计数区，中间的一个大方格为计数室，它的长和宽均为1 mm，深度为0.1 mm，其体积为0.1 mm3。计数室的刻度有两种：一种是把大方格分为16个中方格，而每个中方格又分成25个小方格（图1-21 C）；另一种是把大方格分成25个中方格，而每个中方格又分成16个小方格（图1-21 D）。计数区由400个小方格组成。每个大方格边长为1 mm，其面积为1 mm2，盖上盖玻片后，盖载玻片间的高度为0.1 mm，所以每个计数区的体积为0.1 mm3。使用血球计数板计数时，通常测定5个中方格的微生物数量，求其平均值，再乘以25或16，就得到一个大方格的总菌数，最后再换算成1 mL菌液中微生物的数量。设5个中方格中的总菌数为M，菌液稀释倍数N，则：

图1-21　血球计数板的构造图

A.正面图；B.侧面图；C.16中格计数室放大图；D.25中格计数室放大图

注意：①此方法适用于细胞数较多的样品测定，一般适用于细胞浓度为105～106以上的样品。当样品中的细胞浓度较低时，需选择其他方法测定，否则因误差太大影响实验结果。②此法只能得到微生物细胞的总数，并不能区分活菌和死菌，因此在计数时需注意杂质对结果的影响。

三、溶液试剂

（1）菌种：酿酒酵母、枯草芽孢杆菌。

（2）溶液试剂：0.1%吕氏碱性亚甲蓝染液、蒸馏水。

（3）仪器及其他用品：目镜测微尺、物镜测微尺、普通光学显微镜、擦镜纸、血细胞计数板、盖玻片（22 mm×22 mm）、移液器、滴管、酒精灯、镊子、接种环、试管、锥形瓶、双层瓶（含二甲苯、香柏油）等。

四、实验内容

（一）微生物大小的测定

1.目镜测微尺的安装

把一侧目镜的上透镜旋开，将目镜测微尺轻轻放在目镜的隔板上，使有刻度的一面朝下。旋上目镜透镜，再将目镜插入镜筒内（图1-22）。

图1-22　测微尺及其安装和校正

A.镜台测微尺（a）及其中央部分的放大（b）；B.镜台测微尺校正目镜测微尺时的情况；C.目镜测微尺（c）及其安装在目镜（d）上再装在显微镜（e）上的方法

2.校正目镜测微尺

（1）将物测微尺放在显微镜的载物台上，使有刻度的一面朝上并对准聚光器。

（2）先用低倍镜观察，再用高倍镜、油镜观察。观察时，调焦距。待看清物镜测微尺的刻度后，转动目镜，使目镜测微尺的刻度与物镜测微尺的刻度相平行。移动物镜测微尺，使目镜测微尺的“0”刻度与物镜测微尺的一条刻度线重合，再找另一条重合线。

（3）分别数出两重合线之间物镜测微尺和目镜测微尺所占的格数。各种放大倍数各测量3次，取平均值。用同样的方法换成高倍镜和油镜进行校正，分别测出在高倍镜和油镜下两重合线之间两尺分别所占的格数。

（4）根据下列公式分别计算出用低倍镜、高倍镜和油镜观察微生物时，目镜测微尺每格所代表的实际长度。(www.xing528.com)

（5）移去物镜测微尺，将其洗净、晾干、放回盒内。

3.菌体大小的测定

（1）制作枯草芽孢杆菌的单染色制片：洗片→干燥→加热、固定、干燥→亚甲蓝染色1 min 30 s→自然干燥。

（2）制作酵母水浸片：玻片中央滴一滴亚甲蓝→接种酵母菌→盖盖玻片。

（3）将枯草杆菌染色涂片置于载物台上，先在低倍镜和高倍镜下找到目的物，然后在油镜下用目镜测微尺测量菌体的大小。先量出菌体的长和宽各占目镜测微尺的格数，再以目镜测微尺每格的长度计算出菌体的长和宽，即知菌体大小。

同一种群中的不同菌体细胞之间也存在个体差异，因此在测定每一种菌种细胞大小时应对多个细胞进行测量，然后计算取平均值。一般镜检3～5个视野，每个视野测量3～5个菌体。

（4）同法测量酵母菌体的大小。

（二）显微镜计数

（1）血球计数板清洗。

（2）自然干燥。

（3）对酵母菌液进行适当的梯度稀释。取原液1 mL到试管中，再用移液管移入9 mL水。取上一次稀释的菌液中的1 mL加到另一支试管中，并加9 mL水。依此类推，即可得到一系列稀释梯度的菌液。

（4）加样品。血球计数板盖上盖玻片，将酵母菌液摇匀。用无菌滴管吸取少许，从计数板平台两侧的沟槽内沿盖玻片的下边缘滴入一小滴（不宜过多），让菌液利用液体的表面张力充满计数室，避免气泡产生。用吸水纸吸去沟槽中流出的多余菌液。加样后静置5 min，使细胞或孢子自然沉降。

（5）将加有样品的血球计数板置于显微镜载物台上，先用低倍镜找到计数室所在位置，然后换成高倍镜进行计数。若发现菌液太浓，需重新调节稀释度后再计数。一般要求每小格内有不多于5个菌体。每个计数室选5个中格（可选4个角和中央的一个中格）中的菌体进行计数。若有菌体位于格线上，则计数原则为计上不计下，计左不计右。如遇酵母出芽，芽体达到母细胞大小一半时，可作为两个菌体计数。

（6）每个样品重复计数2～3次（每次数值不应相差过大，否则应重新操作），求出每一个小格中细胞平均数。

（7）清洗。测数完毕，取下盖玻片，用水将血球计数板冲洗干净。切勿用硬物洗刷或抹擦，以免损坏网格刻度。洗净后自行晾干或用吹风机吹干，放入盒内保存，以备下次使用。

五、注意事项

（1）使用物镜测微尺进行校正时，若一时无法直接找到测微尺，可先对标尺外的圆圈线进行准焦，然后再通过移动标本推进器寻找。

（2）细菌的个体微小，在进行细胞大小测定时一般应选用油镜，以减小误差。

（3）进行显微镜计数时应先在低倍镜下寻找大方格的位置，找到计数室后将其移至视野中央，再换高倍镜观察和计数。

（4）酵母菌计数实验中，加样品前一定将菌液摇匀。

（5）为了确定稀释梯度，可以先将酵母菌的原液加到计数板上计数。

六、实验数据记录

实验数据可以表格的形式记录（表1-1至表1-3）。

表1-1　微生物的显微计数（25×16）

表1-2　不同物镜倍数的校正值

表1-3　油镜下细菌细胞大小的测定

（续表）

七、思考题

（1）为什么更换不同放大倍数的目镜或物镜时，必须用物镜测微尺重新对目镜测微尺进行校正？

（2）在不改变目镜和目镜测微尺，而改用不同放大倍数的物镜来测定同一细菌的大小时，其测定结果是否相同？为什么？

（3）哪些因素会造成血球计数板的计数误差，应如何避免？