一、实验目的
（2）学习细菌的鞭毛染色法。
（3）学习细菌的荚膜染色法。
二、实验原理
1.芽孢染色的原理
细菌的芽孢壁厚而致密，透性低，着色和脱色都较难；而菌体易着色和脱色。根据芽孢这一特点，用着色力强的染料将菌体和芽孢都染上颜色，加热，以促进芽孢着色，然后水洗，菌体脱色而进入芽孢的染料则难以渗出。再用对比度强的染料对菌体复染，而芽孢仍保留初染剂的颜色。这样，菌体和芽孢呈现出不同的颜色，便于观察。
2.鞭毛染色的原理
鞭毛是细菌的运动器官，鞭毛的有无、数量及着生方式也是细菌分类的重要指标。细菌的鞭毛极细，直径一般为0.01～0.02μm。除了很少数能形成鞭毛束（由许多根鞭毛构成）的细菌可以用相差显微镜直接观察到鞭毛束的存在外，一般细菌的鞭毛均不能用光学显微镜直接观察到，而要用电子显微镜才行。如采用特殊的染色法，则在普通光学显微镜下也能分辨出细菌的鞭毛。鞭毛染色的方法很多，但其基本原理相同，即在染色前先用媒染剂（如单宁酸或明矾钾）处理、染料沉积在鞭毛上，使鞭毛直径加粗，然后用碱性复红（Gray式染色法）、碱性复品红（Leifson氏染色法）、硝酸银（West氏染色法）或结晶紫（Difco氏染色法）染色。
3.荚膜染色的原理
荚膜是细菌分泌到菌体细胞壁外的一层黏液状物质，主要成分是多糖和多肽类物质，与染料亲和力弱，不易着色，通常采用衬托染色法或称负染色法，使菌体和背景着色，把透明、不着色的荚膜衬托出来。由于荚膜的含水量大，在90%以上，故染色时一般不加热固定，以免荚膜皱缩变形。
三、实验器材
（1）菌种：培养24 h的枯草芽孢杆菌、培养12～16 h的变形杆菌斜面，培养3 d的固氮菌。
（2）染色液和试剂：5%孔雀绿水溶液、番红染色液、鞭毛染色液A液与B液、蒸馏水、香柏油、显微镜擦拭液、绘图墨水或黑色素溶液。
（3）器材：酒精灯、接种环、镊子、载玻片、擦镜纸、吸水纸、记号笔、试管夹、显微镜等。
四、实验方法
（一）芽孢染色
1.涂片
按常规方法将待检细菌制成一薄层的涂片。
2.晾干固定
待涂片晾干后在酒精灯火焰上通过3次。
3.染色
（1）加染色液。加5%孔雀绿水溶液于涂片处，用试管夹夹住涂片，置于酒精灯火焰上加热。染液开始冒蒸汽时计时4～5 min。注意玻片与火焰的距离，使染液冒蒸汽但不沸腾，切勿使标本干涸，必要时添加染液和蒸馏水。
（2）水洗。待玻片冷却后，用水轻轻地冲洗，直至流水无染色为止。
（3）复染。用番红染色液染色2～3 min。
（4）水洗、晾干或吸干。
4.镜检
先用低倍镜，再用高倍镜，最后在油镜下观察芽孢和菌体的形态。
（二）鞭毛染色
1.制片
吸取少量蒸馏水滴在洁净玻片的一端，采用无菌操作在斜面上取菌少许，在蒸馏水中轻沾，立即将玻片倾斜，使菌液缓慢地流向另一端。用吸水纸吸去多余的菌液。涂片放空气中自然干燥。注意防止灰尘。
2.染色
（1）滴加A液，染4～6 min。
（2）用蒸馏水冲洗A液。(www.xing528.com)
（3）用B液冲去残水，再加B液于玻片上，在酒精灯火焰上加热至冒气，维持0.5～1 min（加热时应随时补充蒸发掉的染料，不可使玻片干涸）。
（4）用蒸馏水洗，自然干燥。
3.镜检
先用低倍镜，再用高倍镜，最后用油镜检查（图1-17、图1-18）。
图1-17 枯草芽孢杆菌鞭毛染色
图1-18 鞭毛染色
（三）荚膜染色
1.制菌液
加1滴墨水于洁净的载玻片上，挑少量菌体与其充分混合均匀。
2.推片
图1-19 黑墨水涂片
另取一清洁载玻片一端接触菌液，以30°角进行推片，顺势将菌液刮过（图1-19），使其成均一的薄层。
3.晾干
在空气中自然晾干。
4.镜检
先用低倍镜、再用高倍镜、油镜观察。
五、实验报告
（1）绘出所观察菌种的芽孢和菌体的形态图。
（2）绘出细菌鞭毛的形态及着生位置。
（3）绘出固氮菌的菌体和荚膜的形状。
六、注意事项
用鞭毛染色法准确鉴定一株菌是否有鞭毛，要注意以下环节。
（1）良好的培养物，是鞭毛染色成功的基本条件。不宜用已形成芽孢或处于衰老期培养物作为鞭毛染色的菌种材料，因为老龄细菌鞭毛容易脱落。
（2）玻片要光滑、洁净（用洗衣粉洗），尤其忌用带油迹的玻片（将水滴在玻片上，无油迹玻片水能均匀散开）。这是染色的关键。
（3）挑菌时，尽可能不带培养基。菌量要少。
（4）掌握好染色时间。
七、思考题
（1）用简单染色法能否观察到细菌的芽孢？说明原因。
（2）用鞭毛染色法准确鉴定一株菌是否有鞭毛，要注意哪些环节？
（3）荚膜染色为什么要用衬托染色法？
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