环境工程微生物学实验：微生物染色方法速成指南

一、目的要求

（1）学习微生物的单染色和革兰氏染色原理。

（2）学习掌握单染色和革兰氏染色的操作技术和无菌操作技术。

二、实验原理

微生物染色是微生物学实验中一项重要的基本技术。微生物细胞微小而透明，在普通光学显微镜下不易观察其形态和结构。通常通过染色，使菌体与背景形成明显的色差，便于观察。

用于生物染色的染料主要有碱性染料、酸性染料和中性染料三大类。碱性染料的离子带正电荷，能和带负电荷的物质结合。因细菌蛋白质等电点较低，当它生长于中性、碱性或弱酸性的溶液中时常带负电荷，所以通常采用碱性染料使其着色。例如，亚甲蓝实际上是氯化亚甲蓝盐（methylene blue chloride，MBC）；它可被电离成正、负离子，带正电荷的染料离子可将细菌细胞染成蓝色。常用的碱性染料除亚甲蓝外，还有结晶紫（crystal violet）、碱性复红（basic fuchsin）、番红（又称沙黄，safranine）等。酸性染料的离子带负电荷，能与带正电荷的物质结合。当细菌分解糖类产酸使培养基pH下降时，细菌所带正电荷增加，因此易被伊红、酸性复红或刚果红等酸性染料着色。中性染料是前两者的结合物又称复合染料，如伊红-亚甲蓝、伊红天青等。

染色前必须先固定细菌，其目的有二：一是杀死细菌，使细胞质凝固，菌体黏附于玻片上；二是增加其对染料的亲和力。常用的有加热和化学固定两种方法。固定时应尽量维持细胞原有形态，防止细胞膨胀或收缩。

微生物的染色方法很多，按功能差异可分为简单染色法和复合染色法。简单染色法是利用单一染料对细菌进行染色的一种方法。此法操作简便，可用以观察微生物的形状、大小及细胞排列状态，是微生物技术中应用广泛、操作简便的染色法。复合染色法是用两种或多种染料染色，以区别不同细菌，故又称为鉴别染色法。复合染色法又可细分为革兰氏染色法、抗酸性染色法、芽孢染色法、吉姆萨染色法等。此处单介绍革兰氏染色法。

革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G-）两大类，是细菌学上最常用的重要鉴别性染色法。它的主要步骤是先用结晶紫进行初染；经媒染剂——碘液后用脱色剂（乙醇或丙酮）脱色；最后用番红复染。不被脱色而保留初染剂的颜色（紫色）的细菌为G+菌，被脱色后又染上复染剂的颜色（红色）者为G-菌。该法的染色机制与细菌的细胞壁结构和成分有关。G-菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇或丙酮脱色时，类脂质溶解，细胞壁的通透性增加，结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经番红复染后就成红色。G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后，肽聚糖层的孔径反而缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时的颜色。

三、实验内容

（1）分别以金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、枯草芽孢杆菌（Bacillcus subtilis）和大肠杆菌（E.coli）为材料进行简单染色和革兰氏染色，并通过显微镜观察，判断其反应类型。

（2）学习染色的操作技术和无菌操作技术和方法。

四、实验器材

（1）菌种：枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌。

（2）显微镜、载玻片、擦镜纸、酒精灯、接种环、吸水纸、盖玻片、试管、水浴锅。

（3）草酸铵结晶紫染色液、革兰氏碘液、95%乙醇、0.5%番红染色液、蒸馏水、双料瓶（香柏油和二甲苯）、5%孔雀绿溶液。

五、方法步骤

（一）单染色

1.涂片

在干净的载玻片中央滴上一小滴蒸馏水。先将接种环在火焰上灼烧至变红，等接种环冷却后，再从斜面挑取少量菌种于玻片的水中，将菌种分散并充分混匀涂成薄膜。注意：挑菌量宜少，涂片宜薄，过厚则不易观察。细菌涂片过程见图1-15。

2.干燥

最好在空气中自然晾干，为节省时间，也可将涂片置火焰高处微热烘干。

3.固定

将玻片涂面朝上，在火焰上方快速通过3～4次，使菌体蛋白凝固而完全固定在载玻片上。

图1-15　无菌操作及细菌涂片过程

4.染色

待玻片冷却后加结晶紫（或番红或亚甲蓝）染液1～2滴于涂片上，使染液覆盖菌种涂面，染色1～2 min。

5.水洗

斜置载玻片，倾去染液，在自来水龙头下用细水流自玻片一端轻轻冲洗，至流下的水变无色为止。注意：切勿冲去菌体。(www.xing528.com)

6.干燥

用微热烘干或自然干燥，或用吸水纸吸干涂片边缘的水。注意：切勿擦掉菌种。

7.镜检

用显微镜观察菌体形态及结构，记录下来并用铅笔画出细菌形态结构图。

（二）革兰氏染色

1.涂片、干燥与固定

分别取大肠杆菌和枯草杆菌（均以无菌操作）做涂片。涂片、干燥与固定方法同“（一）单染色”中1、2、3步骤。

2.初染

滴加草酸铵结晶紫染色液，染色1～2 min，水洗。革兰氏染色过程见图1-16。

图1-16　革兰氏染色过程及结果示意图

3.媒染

滴加革兰氏碘液，染色1～2 min，水洗。

4.脱色

滴加95%乙醇，脱色约45 s，水洗，终止脱色。

5.复染

滴加0.5%番红色液，染色2～3 min，水洗，干燥。

6.镜检

将标本涂片置显微镜下观察，先用低倍镜观察，发现目的物后改用油镜观察，并根据菌体呈现的颜色判断其为G+菌还是G-菌。用铅笔绘制细菌的形态结构图并说明革兰氏染色结果。

六、注意事项

（1）涂片用的载玻片要洁净无油污，否则影响涂片效果。

（2）选用培养16～24 h菌龄的细菌为宜。若菌龄太老，由于菌体死亡或自溶常使革兰氏阳性菌转呈阴性反应。

（3）挑菌量宜少，涂片宜薄，过厚则不易观察。

（4）革兰氏染色成败的关键是脱色时间。如脱色过度，革兰氏阳性菌也可被脱色而被误认为是革兰氏阴性菌；如脱色时间过短，革兰氏阴性菌也会被认为是革兰氏阳性菌。脱色时间的长短还受涂片厚薄、脱色时玻片晃动的快慢及乙醇用量多少等因素的影响，难以严格规定。一般可用已知革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌练习，以掌握脱色时间。当要确证一个未知菌的革兰氏反应时，应同时做一张已知革兰氏阳性菌和阴性菌的混合涂片，以资对照。

（5）染色过程中勿使染色液干涸。用水冲洗后，应吸去玻片上的残水，以免染色液被稀释而影响染色效果。

（6）涂片必须干燥后才能置于油镜下观察。

七、思考题

（1）在制作涂片中，为什么要进行固定这一步？

（2）革兰氏染色中哪一步关键，为什么？