荧光显微镜（fluorescence microscope）是以紫外光或蓝紫光作为光源的显微镜，通过它可以看清发出荧光的细胞结构和部位。它常用于荧光素标记标本的观察和非透明样品中的微生物计数。
一、目的要求
（1）了解荧光显微镜的构造和原理。
（2）掌握荧光显微镜的使用方法。
二、基本原理
荧光显微镜与普通光学显微镜基本相同，其主要区别在于光源和激发块。
荧光显微镜利用一个高发光效率的点光源，经过滤色系统发出的一定波长的光（如紫外光365 nm或蓝紫光420 nm）作为激发光，激发标本内的荧光物质发射出各种不同颜色的荧光。通过物镜和目镜的放大，我们可以观察到发出荧光的细胞结构和部位。通过荧光显微镜物镜看到的颜色不是标本的本色，而是荧光的颜色。荧光显微镜分透射式和落射式2种。透射式荧光显微镜的光源位于标本的下方，激发光本身不进入物镜，只有荧光进入物镜，视野较暗。落射式荧光显微镜的光源位于标本的上方，视野较亮，对透明和非透明样品都能进行观察。荧光显微镜及其显微照片见图1-14。
图1-14 荧光显微镜（左）和产甲烷菌荧光显微照片（右）
三、实验材料
（1）菌种：甲酸产甲烷杆菌（Methanobacterium formicicum）液体培养物（2～3支）。
（2）仪器及相关用品：荧光显微镜、香柏油、二甲苯（或1∶1的乙醚酒糟溶液）、擦镜纸、无荧光油、载玻片、盖玻片、吸水纸、酒精灯、1 mL注射器。
四、实验程序
下面以观察产甲烷杆菌为例说明荧光显微镜的使用方法。
（1）用1 mL注射器取少量产甲烷杆菌培养液制成水浸片。
（2）将水浸片安放至载物台的夹紧器上。
（3）开启荧光显微镜稳压器，然后按下启动钮，开启紫外灯（注意：高压汞灯启动15 min内不得关闭，关闭后3 min内不得再启动）。
（4）将激发滤光片转至V，分色片调到V，选用495 nm或475 nm波阻挡滤光片。(www.xing528.com)
（5）选用UVFL40、UVFL100荧光物镜镜检。
（6）在水浸片上加无荧光油，先用40×物镜，再用100×物镜调焦镜检。产甲烷细菌发出淡黄绿色荧光。
（7）受紫外光照射后，荧光物质发出的荧光强度随时间延长而逐渐减弱，镜检时应经常更换视野。
（8）镜检完毕，取下载玻片，做好荧光显微镜的清洁和存放工作。
五、注意事项
（1）使用透射式荧光显微镜时，应注意光轴中心的调整。
（2）镜检应在暗室中进行，并尽量缩短时间。
（3）启动高压汞灯，等待15 min，汞灯稳定后方可使用。不要频繁开启高压汞灯。若在短时间内多次开启，高压汞灯寿命会大大缩短。
（4）镜检标本时，宣先用可见光观察，锁定物像后再换用荧光观察，这样可延长荧光消退时间。
（5）根据被检标本荧光的色调，选择恰当的滤光片。
（6）紫外线可损伤眼睛，应避免直视激发光。所以，在未装荧光遮光板时不要用眼观察，以免引起眼的损伤。
（7）光源附近禁止放置易燃物品。
六、思考题
（1）试述荧光显微镜的工作原理。
（2）试述荧光显微镜的功能。
（3）荧光显微镜的两种滤光片各起什么作用？
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