细菌标本没有染色时，菌体的折光性与周围背景相近，在光学显微镜下不易看清。相差显微镜（phase contrast microscope）是一种能将光线通过透明标本后产生的光程差（即相位差）转化为光强差的特殊显微镜。以相差显微镜观察标本，可以克服光学显微镜的缺陷，看清活细胞及其细微结构，并产生立体感。
一、目的要求
（1）了解相差显微镜的构造特点和工作原理。
（2）掌握相差显微镜的使用方法。
二、基本原理
（一）相差显微镜的工作原理
光线通过透明标本时，光的波长（颜色）和振幅（亮度）不会发生明显的变化。因此，采用普通光学显微镜观察未经染色的标本，难以分辨细胞的形态和内部结构。然而，由于细胞各部分的折射率和厚度不同，光线穿过标本时，直射光和透射光会产生光程差，并由此导致光波相位差（图1-6）。通过相差显微镜上的特殊装置——环状光阑和相板，利用光的干涉原理，可将光波的相位差转变为人眼可以察觉的振幅差，即明暗差（图1-7）。视野上的明暗差可增强检视物的对比度，从而看清在普通光学显微镜下不易看到的活细胞及其细微结构（图1-8）。
图1-6 直射光与透射光相互干涉而抵消，在明亮的视野中产生黑暗的物像
图1-7 相差显微镜成像原理
图1-8 普通显微镜的物像（上）与相差显微镜的物像（下）
（二）结构特点
用环状光阑代替可变光阑，用带相板的物镜（通常标有Ph或一个红圈）代替普通物镜，并带有一个合轴调节用的望远镜。
（三）相差显微镜的构造
奥林巴斯（OLYMPUS）生物显微镜是从日本进口的一种双筒光学显微镜。它是目前微生物实验室中常用的研究工具。现以奥林巴斯生物显微镜为例介绍相差显微镜的构造。
奥林巴斯生物显微镜由照明系统、机械系统和光学系统组成（图1-9）。照明系统包括电源、插头、主开关、电压调整旋钮、保险丝、灯泡等。调节电压调整旋钮可以控制显微镜光源的亮度：随着电压增大，亮度也增大。
图1-9 奥林巴斯显微镜的构造
机械系统包括底盘（镜座）、镜架（镜臂）、镜筒、载物台、转换器、调节器等。底盘支撑整个显微镜。镜架连接显微镜各部分。镜架上的调节器（粗调控制钮和微调控制钮）可以调节镜筒的伸缩。粗调控制钮上有重量调节环，向顺时针旋转，可加重转动粗调控制钮所需的力量。粗调控制钮上还设有粗调锁档，调节粗调控制钮把焦点对准标本后，固定粗调锁档可限制粗调控制钮运动。换片后，将粗调控制钮调至粗调锁档固定的位置上，可以快速对焦，只要调节微调控制钮就可找到清晰的物像。镜架上的载物台由夹紧器和“十”字调节钮组成。夹紧器（功能类似压片夹）用于固定载玻片标本。“十”字调节钮用于调节标本的前后左右移动。镜筒上部设有镜筒长补偿环，转动补偿环可以调节双目镜筒的视度差，拉动镜筒还可以调节双目镜筒间距。镜筒下部设有物镜转换器（图1-10），可以选用不同放大倍数的物镜。
光学系统包括目镜、定中心望远镜、相差物镜、聚光镜、环状光阑、绿色滤光片等。奥林巴斯生物显微镜具有2个镜筒，2个目镜，常用的放大倍数为10×和15×。定中心望远镜（图1-11）也称辅助目镜或合轴调整望远镜，是相差显微镜的一个重要部件。使用时拔出目镜，安装在镜筒上端，用以调节环状光阑与相环的重合（图1-12），使环状光阑中心与相差物镜光轴处在一条直线上。相差物镜是相差显微镜的另一个重要部件。相板安装在物镜的后焦平面上（图1-7），可改变直射光和透射光的振幅和相位。相差物镜上刻有红色Ph（phase的缩写）或一个红圈标记。奥林巴斯相差物镜用红圈标记。常用相差物镜放大倍数有10×、20×、40×（弹簧加重）和100×（弹簧加重）。聚光镜位于载物台下面，可上下移动，调节进入物镜光线的强弱。环状光阑（图1-12）位于聚光镜下面，也是相差显微镜的重要部件。环状光阑上有一环状的光线通道，来自光源的直射光只能从环状通道穿过，形成一个空心圆筒状的光柱，通过聚光镜照射到标本以后，一部分保持直射光，另一部分转变为透射光，产生相位差。环状光阑设置在一个转盘上（图1-12），相差转盘的各环状光阑边上刻有10×、20×和40×等字样，与不同放大倍数的物镜相匹配。相差显微镜还有一个重要部件是绿色滤光片。插入绿色滤光片，可使光源波长一致，加强干涉效果。
图1-10 物镜转换器
图1-11 定中心望远镜
图1-12 环状光阑与环状光阑转盘
三、实验器材
（1）菌种：培养12～18 h的枯草杆菌（Bacillus subtilis）。
（2）标本片：3种基本形态的细菌染色标本。
（3）仪器及相关用品：显微镜、香柏油、二甲苯（或1∶1的乙醚酒精液）、擦镜纸、载玻片、盖玻片、吸水纸、酒精灯、接种环。
四、实验程序
奥林巴斯生物显微镜既可作为普通光学显微镜使用，也可作为相差显微镜使用。
（一）作为普通光学显微镜使用(www.xing528.com)
（1）接通电源。
（2）打开主开关。
（3）移动电压调整旋钮，使光亮度适中。
（4）把载玻片标本安放到载物台的夹紧器上。
（5）调节目镜镜筒间距和视度差。
（6）松开粗调锁档。
（7）将环状光阑转盘调至0处（对准通光孔）。
（8）选用低倍镜，旋转粗调和微调控制钮对焦。
（9）锁定粗调锁档。
（10）换用中倍和高倍镜观察。
（11）换用油镜观察：移开高倍镜，在载玻片标本上加一滴香柏油，将油镜浸至油滴中，提升聚光镜，旋转微调控制钮，直至见到清晰的物像。
（12）观察完毕，参照普通光学显微镜的要求用擦镜纸擦净镜头，将电压调节旋钮调至0处，关闭主开关，拔出电源插头，清理并收存好显微镜。
（二）作为相差显微镜使用
（1）相差设备的安装：取下原有聚光镜和物镜，安上相差聚光镜和相差物镜，并将环状光阑转盘调至10×处，用10×相差物镜调节光强。
（2）光源调节：接通电源，打开主开关，移动电压调整旋钮，使光亮度适中。将绿色滤光片插入滤光片支架中。
（3）标本放置：把载玻片标本安放至载物台的夹紧器上。
（4）目镜调整：调节目镜镜筒间距和视度差。
（5）视野调整：松开粗调锁档，用10×相差物镜观察，调焦至看清物像。打开或缩小虹彩光阑1～2次，可见明亮视野的面积跟着变化。调节虹彩光阑，使视野中央亮度较大且较均匀。
图1-13 调节环状光阑转盘上的调中螺旋调整中心轴
（6）中心轴调整：取下原有目镜，换上定中心望远镜。升降镜筒，至看清物镜中的相环。由于相板位置是固定的，而环状光阑的位置是可变的，因此可操纵相差聚光镜调节柄（图1-13），使相环与环状光阑的亮环完全重合。
（7）样本观察：取下定中心望远镜，放回目镜即可进行标本观察。
（8）中、高倍镜观察：依次用中、高倍相差物镜观察低倍镜下锁定的部位，并随着所用相差物镜放大倍数的增加，旋转环状光阑转盘以提高环状光阑的放大倍数，逐步提升聚光镜，增强光线亮度。
（9）油镜观察：将聚光镜提升至最高点，并将环状光阑的放大倍数置于100×。转动转换器，移开高倍镜，使高倍镜和油镜成“八”字形。在标本中央滴一小滴香柏油，使油镜镜头浸入香柏油中。微微转动细调控制钮，直至看见清晰的物像。如果在更换不同放大倍数的相差物镜时，物像看不清楚，则需要重复（6）（7）步骤。
（10）用后复原：观察完毕，取下载玻片，用擦镜纸擦净镜头，将电压调整旋钮调至0处，关闭主开关，拔出电源插头。对照普通光学显微镜的要求，清理并收存好显微镜。
五、注意事项
（1）载玻片厚度应控制在1 mm左右，盖玻片厚度不超过0.17 mm。
（2）虹彩光阑应充分打开，以提高光强。
（3）不同型号的光学部件不能互换使用。
六、思考题
（1）试述相差显微镜的光学原理。
（2）相差显微镜有哪些重要部件？它们各有什么作用？
（3）为什么说倒置显微镜、相差显微镜是观察培养活细胞的最有效显微镜？
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