实验结果：普通光学显微镜的结构、原理及使用

普通光学显微镜简称光学显微镜（light microscope），以平均波长为550 nm的可见光作为光源，能分辨的两点距离约为0.22μm。多数细菌的个体大于0.25μm，因此可在光学显微镜下观察。由于许多细菌的大小与光学显微镜的分辨率处于同一个数量级，为了看清细菌的形态与结构，经常使用油镜来提高显微镜的分辨率。在光学显微镜的使用中，油镜的使用是一项十分重要的操作技术。

一、实验目的

（1）了解普通光学显微镜的主要构造、原理及其性能，掌握显微镜的操作和保养方法。

（2）掌握低、高倍镜的正规使用方法，反复练习，观察时保持两眼同时睁开和两手并用。

（3）结合实验室提供的实验装片观察微生物的形态，并学习测量微生物大小的方法。

二、实验器材

（1）微生物实验装片。

（2）显微镜、目测微尺、物测微尺、载玻片、盖玻片等。

（3）香柏油、二甲苯、擦镜纸等。

三、实验步骤

（一）显微镜的结构和各部分作用

显微镜是观察微观世界的重要光学仪器。它是微生物实验常用工具之一，其作用是将标本放大，以便观察和分析。普通光学显微镜的结构包括机械装置和光学系统两大部分，如图1-1所示。

图1-1　普通光学显微镜的构造

1.机械装置

（1）镜座：为马蹄形，位于显微镜的最底部，为整个显微镜的基座，支持着整个镜体，起稳固作用；镜座上装有反光镜（有的装有灯源）。

（2）镜臂（主体）：为支持镜筒、载物台、聚光器和调节器的马蹄形结构，也是移动显微镜时手握的部位。镜臂有固定式和活动式（可改变倾斜度，但使用时倾斜角度不应超过45°，否则显微镜容易翻倒）2种。

（3）调节器：为焦距的调节部分，又称调焦装置，位于镜臂的上端（镜筒直立式光镜）或下端（镜筒倾斜式光镜），用于调节物镜与标本间的距离，使物像更清晰。调节器分粗调节器（粗准焦螺旋）和细调节器（细准焦螺旋）。粗调节器转动1圈可使镜筒升或降约10mm，可使镜筒或镜台较大幅度地升或降，能迅速调节好焦距，用于低倍镜观察时调焦。细调节器转动1圈可使镜筒升或降约0.1mm，使镜筒或镜台较小幅度地升或降，用于在低倍镜下用粗调节器找到目标物后，在高倍镜和油镜下进行焦距的精细调节，可以对物体不同层次、深度的结构进行细致观察。

（4）镜筒：镜筒长度一般是160mm，位于镜臂的前方，它是连接目镜和物镜的金属圆筒，其上端插入目镜，下端连接物镜转换器。根据镜筒的数目，光镜可分为单筒式和双筒式。单筒光镜又分为直立式和倾斜式两种镜筒，直立式的目镜与物镜的光轴在同一直线上，而倾斜式的目镜与物镜的中心线互成45°角，在镜筒中装有使光线转折45°的棱镜。双筒式光镜的镜筒均为倾斜式的，镜筒长度通常为160mm，有的显微镜的镜筒长度可调节。

（5）转换器：又称旋转盘，位于镜筒下端，一般装有2～4个放大倍数不同的物镜。物镜一般按由低倍到高倍的顺序安装。旋转转换器就可以转换物镜。当旋至物镜和镜筒成直线时，会发出“咔”的响声，这时方可观察玻片标本。注意：转换物镜时，必须用手旋转圆盘，切勿用手推动物镜，以免损坏物镜。

（6）载物台：也称镜台，位于镜臂下方，用于放置玻片标本。载物台中央有一圆形的通光孔，光线可以通过它由下向上反射。载物台上装有2片固定玻片的压片夹，还装有标本移动器，转动标本移动器螺旋可以前后、左右移动标本。移动器上带有标尺，可指示标本的位置，便于反复观察。

2.光学系统

光学系统包括目镜、物镜、聚光器、反光镜等。

（1）反光镜：是装在镜台下方的可转动的平凹两面圆镜，可自由转动方向，用于反射光线至集光器。平面镜聚光力弱，适合光线较强时使用。凹面镜聚光力强，适于光线较弱或无聚光器的显微镜使用。转动反光镜，可将光源反射到聚光器上，再经载物台中央圆孔照明标本。

（2）聚光器或称集光器：在载物台下方，用来集合由反光镜反射来的光线。它可以上、下调整，中央装有光圈，用以调节光线的强弱。当光线过强时，应缩小光圈或把集光器向下移动。

（3）虹彩光圈：是在聚光镜底部的一个圆环状结构，其上有许多大小不一的光圈（也称光阑或虹彩光圈）。可以旋转虹彩光圈以调节通光孔、镜头的进光量，使物像更清晰。

（4）目镜（接目镜）：装在镜筒上端，作用是把物镜放大的实物再放大一次，并把物像映入观察者的眼中。一般使用的显微镜有2～3个目镜，其上刻5×、10×或15×等数字及符号，分别表示使用时可以放大5倍、10倍或15倍。目镜内常装有一指示针，用以指示要观察的某一部分。

（5）物镜（接物镜）：在成像中起最重要的作用。装在物镜转换器上，一般分低倍镜、高倍镜和油镜3种。低倍镜镜体较短，放大倍数小；高倍镜镜体较长，放大倍数较大；油镜镜体最长，放大倍数最大。在镜体上刻有数字：低倍镜一般有4×、10×两种，高倍镜一般有40×、45×两种，油镜一般是90×、100×两种（×表示放大倍数）。

显微镜放大倍数的计算：目镜放大倍数×物镜放大倍数=显微镜对实物的放大倍数。例如，用放大40倍的物镜与放大10倍的目镜所得的物象的放大倍数为400倍；如果用放大15倍的接目镜则放大倍数为40×15=600（倍）。目镜装在镜筒上端，在使用过程中并不经常变动，所以通常所谓的低倍镜、高倍镜或油镜的观察主要是指使用不同的物镜而言的。

油镜的放大倍数最大（90倍或100倍）。放大倍数这样大的镜头，焦距很短，直径很小，所以自标本玻片透过的光线，因介质密度（从玻片至空气，再进入油镜）不同，有些因折射或全反射，不能进入镜头，致使进入的光线过少，物象显现不清楚。所以，为了不使通过的光线有所损失，须在油镜与玻片中间加入和玻璃折射率相仿的镜油。因为这种物镜使用时要加镜油，所以我们叫它油镜。一般的低倍镜或高倍镜使用时不加油，所以我们叫它干镜。

使用低倍镜和高倍镜时，一般做活体的观察，不进行染色。在观察细小动物时，低倍镜容易看到物体的全貌，主要用来区别动物的种类和看出它们的活动状态；而高倍镜则可以看出动物的结构特征。油镜在大多数情况下用来观察染色的涂片。

（二）显微镜的光学原理

显微镜的性能主要取决于分辨力（resolving power）的大小，也叫分辨率。利用显微镜观察微生物时，希望能看见最细微的部位，即分辨力（分辩本领）要高。分辨力是指显微镜能够辨别物体两点间最小距离的能力，主要是由物镜来决定的。分辨力与物镜的数值口径成反比，与镜检时光波长度成正比，可用下式表示：δ=0.61×λ/NA。

数值口径（亦称开口率，numerical aperture，简写为NA）越大，光波越短，则所能辨识的物体越小。普通光学显微镜所用的照明光源不可能超过人们肉眼所能感受的光（即可见光）波长范围（400～700 nm），平均光波长度为0.55μm，试图通过缩短光的波长提高物镜的分辨率是不可能的。如用放大倍数为90倍的油镜（NA=1.25）和放大倍数为9倍的接目镜时，其总放大倍数虽为810倍，但分辨力为0.61×0.55/1.25≈0.27（μm），即所能分辨的最小物体为0.27μm。即便用倍数更大的接目镜，使显微镜的总放大率增加，也仍然分辨不出小于0.27μm的结构。

数值口径可由下式计算：NA=n·sinα。α为镜口角（最大入射角）的一半。n为介质折射率。镜口角（图1-2）的大小决定于物镜透镜的直径和焦距，是显微镜光学质量的关键。介质的折射率：空气的是1，水的是1.33，香柏油的是1.515。油镜头焦距短，镜口角大，又滴加香柏油作为介质，因而其数值口径最高。

使用油镜必须加油的另一原因是避免散光现象。空气折射率和玻璃的折射率（1.52）相差较大，当光线经载坡片，再经空气进入物镜时，部分光线将因折射而散失，视野得不到足够的照明；如果加香柏油，则因其折射率与玻璃折射率相近，可使视野光亮充足（图1-3）。

图1-2　物镜的镜口角

图1-3　光线在不同介质中的折射情况

（三）显微镜的使用方法

1.低倍镜的使用(www.xing528.com)

（1）取下镜罩（或打开镜箱），右手紧握镜臂，左手托住镜座，把显微镜轻放在实验台上，直立平移（图1-4），镜臂对向胸前，坐下进行操作（图1-5）。检查各部件是否完好，镜身、镜头必须清洁。

图1-4　显微镜的移动

图1-5　显微镜的放置

（2）用手转动粗调节器，使镜筒上升；然后转动物镜转换器，使低倍镜对准镜台中央圆孔。

（3）对光：打开开关，调节光线（不宜用直射阳光，宜用散射光）；旋转载物台下方的遮光器，调节光圈。用左眼（两个眼睛都要睁开）通过目镜观察，升高聚光器，用手调整反光镜。一般在光线较强的天然光源下，宜用平面反光镜；光线较弱的天然光源或人工光源，宜用凹面镜。对光时要求整个视野均匀明亮。镜检染色标本时宜用强光；镜检未染色的标本时，宜用弱光。

（4）放置玻片标本：转动粗调节器提升镜筒，使低倍镜镜头升至最高位。取玻片标本放在镜台上，有盖玻片的一面朝上。用压片夹夹住玻片两端，然后转动标本移动器螺旋，移动玻片，使玻片上要观察的标本位于载物台中央圆孔（通光孔）中央。

（5）调节焦距（也称对焦）：转动粗调节器，使低倍物镜镜头缓慢下移至距玻片0.5 cm左右（注意：切记从显微镜侧面观察物镜镜头与玻片的距离，同时转动粗调节器，以免镜头触碰损坏玻片）。

（6）用左眼对着目镜观察，用手慢慢向上转动粗调节器。当视野中看到物像轮廓时，改调细调节器，直至视野中出现清晰的物像。若粗调节器旋得太快，超过焦点，则需要按（5）重调。如果物像不在视野中央，可稍微转动标本移动器螺旋，移动玻片位置（注意：移动玻片的方向与观察物像移动的方向恰好是相反的）。

（7）观察时双眼同时睁开，以免眼睛疲劳。应练习习惯用左眼观察，右眼看着绘图。

反复练习上述操作，直到迅速熟练地找到目标物像。

2.中、高倍镜的使用

（1）一定要先在低倍镜下找到要观察的目标物像后，才能用中、高倍镜观察。

（2）慢慢转动物镜转换器，依次使中、高倍镜（较长的物镜）转到镜台中央圆孔处，同时从侧面进行观察，防止镜头触碰玻片。如果高倍镜镜头碰到玻片，应重新转换用低倍镜调节物距。

（3）调节焦距：转换好高倍镜后，用左眼从目镜中观察。如果视野较暗，可调节光圈和聚光器提高视野亮度。如果要观察的部分不在视野当中，则向上或向下慢慢转动细调节器微调至物像清晰（注意：此时切勿使用粗调节器），一般只需转动半圈或一圈就能达到要求。若要观察的部位不在视野中，可调节标本移动器螺旋，将目标部位移至视野中央。

3.油镜的使用

（1）先按从低倍镜到高倍镜的顺序依次找到目标物像并将其移至视野中央。

（2）用粗调节器将镜筒提高1.5～2 cm，滴加一滴香柏油（或液体石蜡）至载玻片上，将油镜头转到镜筒下方。

（3）眼睛侧面注视，转动粗调节器缓慢降下镜筒，直到油镜头浸没在油中，镜头贴近玻片但不能触碰，避免压碎载玻片、损坏油镜头。此时从目镜观察，调节光圈和聚光器，增加亮度；微微转动细调节器，直到物像清晰。

（4）调换标本：观察新标本玻片时，必须重新从（1）开始操作。

（5）用后复原：观察完毕，转动粗调节器提升镜筒，取下载玻片，先用擦镜纸擦去镜头上的香柏油，再用擦镜纸蘸少许二甲苯或1∶1的乙醚酒精溶液（香柏油可溶于二甲苯及1∶1的乙醚酒精溶液），擦净镜头上的残留油迹，之后用干净的擦镜纸擦去残留的二甲苯或1∶1的乙醚酒精溶液。降低镜筒，载物台降至最低，将物镜转成“八”字形置于载物台上方。降低聚光器，避免聚光器与物镜相碰。使反光镜垂直于镜座，以防受损。将镜罩在显微镜上放回显微镜箱中锁好。

（四）目镜测微尺和物镜测微尺及其使用方法

1.目镜测微尺

目镜测微尺是一圆玻片，其中央有精确的刻度。刻度的大小，随使用的目镜和物镜的倍数及筒长而改变，使用前应用物镜测微尺进行标定。

2.物镜测微尺

物镜测微尺是厚玻片，中央有圆盖玻片。圆盖玻片上有100等份刻度，每等分的长度为1/100 mm。使用时先将目镜测微尺装在接目镜的隔板上，使刻度朝下；把物镜测微尺放在载物台上，使刻度朝上。用平常观测的方法，先找到物镜测微尺的刻度，再移动物镜测微尺与目镜测微尺使两者的第一线重合，然后计算物镜测微尺的每一小格有目镜测微尺的小格数目，计算后者刻度表示的长度。如物镜测微尺的一小格相当于目镜测微尺的5格，则目镜测微尺在此种条件下，每格的长为2μm。如在同样条件下测量物体，而物体的长为目镜测微尺的2小格，宽为半小格，知物体的大小为1μm×4μm。

（五）显微镜的保养

显微镜的光学系统是显微镜的主要部分，尤其是物镜和目镜。一架显微镜的机械装置虽好，但光学系统不好，显微镜的作用就不会好。

显微镜应避免直接在阳光下曝晒，因透镜与透镜之间，透镜与金属之间都是用树脂或亚麻仁油黏合起来的。金属和透镜的膨胀系数不同。因受高热膨胀不均，透镜可能脱落或破裂。树脂受高热可能熔化，导致透镜脱落。

显微镜应避免和挥发性药品或腐蚀性酸类放在一起，如碘片、酒精、乙酸、硫酸等。这些物品对显微镜的金属部分和光学部分都是有害的。

显微镜镜头玷污后，要用擦镜纸或软绸擦拭。用有机溶剂擦拭油镜镜头，用旦不宜过多，时间不宜过长，以免黏合透镜的树脂融化。切不可用手摸透镜。沾染有机物的镜头影响观察，日久还要长霉菌。

油漆或塑料表面的清洁：①避免使用任何有机溶剂（如酒精、乙醚、稀释剂等）清洗仪器的油漆或塑料表面而建议使用硅布，更多的顽固污脏可以用软性清洗剂清洗。②塑料表面只能用软布蘸上清水来清洁。

显微镜不能随意拆卸，尤其是镜筒。因为拆卸后空气中的灰尘和有机物落入里面，容易生霉。机械部分要经常加润滑油，以减少磨损。

显微镜存放：①显微镜不用时，镜罩盖好，放在干燥、清洁、平稳、无腐蚀性气体和阴凉通风的地方。②物镜和目镜应保存在干燥器一类的容器中，并放干燥剂。③镜架应放入镜箱内，并加罩防尘；箱内应存放硅胶，以免受潮生霉。

粗动手轮松紧的调节：请一定使用调节手轮，切忌将两个粗动手轮向相反的方向同时旋转，以免造成损害。

为保持显微镜的性能，应进行定期检查。

四、思考题

（1）镜检玻片标本时，为什么要先用低倍物镜，而不直接用高倍接物镜或油镜观察？

（2）如何正确使用油镜？