实验动物与大鼠间质细胞的分离与培养方法

1.1　主要仪器

SN-682放射免疫γ计数器，CMIAS-8真彩色病理图像分析系统以及XSZZ-D2倒置生物显微镜。

1.2　主要试剂

人绒毛膜促性腺激素(hCG)，日本山田株式会社产品；F10粉剂，美国Life Technologies公司产品；牛血清白蛋白(BSA)，进口原料华美公司分装。二丁酞环腺昔酸(dbc-AMP)、维拉帕米(verapamil)、CYX、STI和Ⅱ型胶原酶，均为Sigma公司产品。反义cmyb ODN序列为 5-‘GTGTCGGGGTCTCCGGGC-3’；无义 tat ODN序列为 5-‘CATTTCTTGCTCTCC-3’；两者均用硫代磷酸修饰，为上海生物工程中心合成。睾酮放射免疫分析药盒：天津九鼎医学生物工程有限公司产品。Myb癌基因蛋白免疫组织化学染色试剂盒：兔抗鼠Myb癌基因蛋白，美国Santa Cruz公司产品；试剂盒其余部分为北京中山生物技术有限公司产品。

1.3　实验动物及大鼠间质细胞的分离与培养

选用成年雄性Sprague-Dawley大鼠，体重280±20g，颈椎脱臼处死，迅速取出睾丸，去掉睾丸被膜，按流程［5］迅速分离间质细胞，然后将纯化的间质细胞用F10培养液调整细胞密度为1.0×106/ml，分装，每组6份，预孵育20min后，实验组加入试剂，对照组(hCG组)不加，继续孵育4 h后取出。离心，上清液置于-20℃待测睾酮；细胞沉淀涂于玻片上，待测细胞内癌基因蛋白。(www.xing528.com)

1.4　测试方法

睾酮用放射免疫分析法(RIA)测定。批间及批内变异系数分别小于10%和5%。细胞内c-Myb癌基因蛋白用免疫组织化学方法测定。细胞涂片上有c-Myb蛋白的部位呈现棕黄色，用CMIAS-8真彩色病理图像分析系统检测各组间质细胞涂片中c-Myb蛋白积分光密度(IOD)值。

1.5　统计学分析

实验数据用±s表示。用统计软件SPSS 10.0 for windows进行统计处理。计量指标满足条件用方差分析统计。以P＜0.05为差异有统计学意义。