大气压非平衡等离子体射流在生物医学中的毒性分析与讨论

1.三种处理方法对细胞胞内ROS的影响

两种细胞在经过不同方法处理1h 后细胞内ROS 水平变化情况如图6.4.8所示。根据前面的结果，和及它们的组合对两种细胞几乎都没有细胞毒性，因此它们对两种细胞胞内ROS水平的影响没有测量。

由图6.4.8可以发现，两种细胞在经过RONS溶液、PAM 及N-APPJ直接处理后，细胞内ROS水平与对照组细胞相比都有所提高，但是当用H2O2、或者PAM 处理时，相同处理条件下HaCaT 细胞胞内ROS水平相对于对照组的增长幅度要高于A875细胞的（见图6.4.8（a）、（b）和（c））。而用N-APPJ直接处理时，A875细胞胞内ROS的增长幅度则高于HaCaT 细胞（见图6.4.8（d））。此外，如图6.4.9（a）和（b）所示，当细胞在800μmol/L H2O2及200μmol/L H2O2+500μmol/作用时，两种细胞胞内ROS水平都开始下降，这是由于在这两种情况下，外源性RONS浓度过高，细胞毒性过强，在测量过程已经有部分细胞开始死亡并从培养孔底部脱落，导致最终ROS的测量结果偏低。

2.细胞贴壁能力对实验结果的影响

如图6.4.9所示，HaCaT 细胞和A875细胞在形态、大小上有明显的差异。此外，这两种细胞的贴壁能力也有显著区别。具体地，当利用胰蛋白酶将处于贴壁状态的两种细胞进行消化下来做相关实验处理时，HaCaT 细胞需要用胰蛋白酶在37 ℃细胞培养箱中处理8～10min后才能从培养瓶底面脱落下来，而A875细胞只需要用胰蛋白酶在室温下处理1min即可。

图6.4.8　HaCaT 细胞和A875细胞在不同处理方法处理1h后细胞内ROS水平变化情况

图6.4.9　HaCaT 细胞和A875细胞形态学差异(www.xing528.com)

两种细胞贴壁能力上的差异对在用RONS溶液和PAM 对细胞进行处理的实验基本没有影响，然而当用N-APPJ直接处理细胞时，由于N-APPJ产生的物理作用力，位于N-APPJ下方的A875细胞在处理后很容易就从培养孔的底面壁上脱落下来。当减少N-APPJ直接处理时的培养基体积时，这种现象会变得更加明显。图6.4.10（a）和（b）分别是细胞培养基体积为100μL 和50 μL两种情况下，当用等离子体射流直接处理1min，24h后位于等离子体射流直接处理下方区域A875细胞的生长情况，图中红色圆圈内基本无细胞的区域面积占培养孔的底面面积分别为2.5%和12.4%，图6.4.10（c）是相应的对照组细胞。在等离子体直接处理HaCaT 细胞时并没有出现相似的情况。这些结果说明两种细胞自身贴壁能力的差异可能在N-APPJ直接处理选择性杀死A875的过程中起到了一定的作用。

图6.4.10　等离子体直接处理1min后培养24h细胞生长情况

6.2节的实验结果表明PAM 可以选择性杀死HepG2细胞，而由本节的实验结果可以看到，在相同的处理条件下，化学方法配制的RONS 溶液和PAM 不仅不能选择性杀死A875细胞，反而HaCaT 细胞的存活率更低。当处理时间合适时，N-APPJ直接处理则能够达到选择性杀死A875 细胞的效果。这一实验结果说明，PAM 和N-APPJ直接处理的生物医学效应存在差异，PAM 处理并不能代替等离子体直接处理。进一步地，将N-APPJ直接处理后细胞培养液中及的浓度与PAM 中对应粒子的浓度进行比较，可以发现两种情况下这些长寿命粒子的浓度范围基本一致，仅就选择性杀死A875细胞而言，这些长寿命活性粒子可能并没有起到重要的作用。

关于出现以上实验结果的原因，可以从细胞自身特性和三种处理方式的区别来进行分析。首先，癌细胞与正常细胞之间的显著区别是癌细胞相比于正常细胞有着更快的代谢和增殖速度，这主要依赖癌细胞细胞膜上的NADPH 氧化酶的持续表达，从而以维持肿瘤细胞的自分泌增殖刺激[46～49]。同时为了及时清除NADPH 氧化酶代谢产生的H2O2，癌细胞膜上的过氧化氢酶会持续作用从而使癌细胞保持高水平的抗氧化活性，而正常细胞的细胞膜上则缺乏相应的过氧化氢酶[50～52]。这可能是同样浓度的H2O2溶液单独作用时A875细胞胞内ROS水平增长幅度低于HaCaT 细胞、存活率要高于HaCaT细胞的原因。

至于为何N-APPJ直接处理能够选择性杀死A875细胞，可能与直接处理时产生的短寿命粒子及A875细胞的弱贴壁能力相关。许多研究人员认为，PAM 中的H2O2与之间的协同作用是PAM 选择性杀死癌细胞的必要条件，因为过氧亚硝酸（ONOOH）会通过二者之间的反应生成[53～54]。最近，Bauer通过配制的RONS溶液模拟PAM 对人胃癌细胞的作用进一步发现，PAM 中的ONOOH 会与剩余的H2O2进一步反应生成O2NOOH，O2NOOH分解释放的1O2会使肿瘤细胞内起保护作用的过氧化氢酶失活，并最终导致癌细胞凋亡[50]。当采用N-APPJ直接处理时会有大量的1O2通过电子碰撞反应产生并能及时与细胞发生作用。此外，Lin等人发现等离子体直接处理过程中产生的短寿命粒子（如1O2和OH·）是导致癌细胞免疫死亡（immunogenic celldeath，ICD）的主要原因[55]，因此，ICD 可能是N-APPJ直接处理过程中A875细胞死亡的一种重要的方式。

此外，比较6.3节与6.4节的实验结果可以看到，PAM 能够选择性杀死HepG2细胞而不能选择性杀死A875细胞，这说明肿瘤的类型会对PAM 的选择性产生重要的影响，这一点与Biscop等人的发现[23]一致。这启示今后在将N-APPJ及PAM 应用到癌症治疗时，需要充分评估不同癌症类型对N-APPJ两种处理方式作用效果的影响。

最后需要指出的是，在通过化学配比RONS溶液时，这里仅考虑了三种主要的长寿命成分。为了使化学配比的RONS更接近于PAM，将来需要增加其他一些成分，如过氧亚硝酸（ONOOH）等，并进一步考虑液体酸碱性的影响。