PAM对肝癌细胞的选择性杀伤机理分析与讨论

首先，为了确认PAM 处理后的那些未贴壁的细胞到底是坏死还是凋亡引起的，实验中采用TUNEL法并结合荧光显微镜对未贴壁细胞的凋亡情况进行了检测，结果如图6.3.4所示。由图6.3.4（c）所示结果可以看出，在用NAPPJ处理时间为15 min 的PAM 培养24h 后，大部分的未贴壁细胞都被TUNEL法对应的红色荧光标记。这一结果说明细胞凋亡是PAM 导致HepG2细胞和L02细胞死亡的主要方式。为了探究PAM 选择性杀死HepG2细胞的原因，进一步对N-APPJ处理后，PAM 的pH 值、PAM 中H2O2，以及和的浓度之和进行了检测，结果如图6.3.5所示。由图6.3.5（a）可以发现，N-APPJ处理后，PAM 的pH 值最多上升了0.2左右，而将培养基暴露于空气下，培养基的pH 值最多上升了0.3，两种情况下pH 值的上升曲线基本重合，这说明培养基pH 值的变化不是N-APPJ处理导致的，培养基pH 值的变化不是PAM 杀伤癌细胞的原因。由图6.3.5（b）和（c）可以看到，随着N-APPJ处理时间的增长，PAM 中H2O2的浓度以及和的浓度之和逐渐增加。当N-APPJ处理时间为15min时，PAM 中H2O2的浓度约为720μmol/L，和的浓度之和约为50μmol/L。

图6.3.4　未贴壁细胞凋亡检测结果[45]

采用共培养模式（HepG2∶L02=1∶3）并且两种细胞在用PAM（N-APPJ处理15min）培养24h后再检测(www.xing528.com)

由以上实验结果可以发现，不管是将HepG2细胞和L02细胞分开培养，还是将两者细胞以不同比例混合后进行共培养，在用相同的PAM 培养24h后，L02细胞的贴壁率都要高于HepG2 细胞的。这说明相对于人正常肝细胞，PAM 能够选择性杀死肝癌细胞。同时也应该注意到，当PAM 对应的NAPPJ时间处理过长时，PAM 也会对L02细胞产生比较严重的伤害。因此在用PAM 处理HepG2细胞时需要选择合适的PAM“剂量”，使PAM 在有效杀死HepG2细胞时尽量降低对正常L02细胞的损伤。仅就本节的N-APPJ装置和实验参数，可以发现N-APPJ处理10min对应的PAM 有最佳的处理效果。PAM 选择性杀伤癌细胞具有最优剂量，可能存在如下两个原因：一方面是在高剂量的PAM 存活下来的癌细胞本身具有较高的抵抗PAM 杀伤的能力，这导致进一步提高PAM 的剂量时，对癌细胞的杀伤作用提升并不明显；另一方面PAM 能够选择性杀伤癌细胞的原因在于癌细胞相对于普通细胞对RONS毒性更加地敏感，但是在较高剂量的PAM 中，高浓度的RONS也会杀伤普通细胞，这导致高剂量PAM 作用时，普通细胞也遭受到了较多的杀伤。这两方面的原因导致PAM 对于癌细胞的选择性杀伤存在一个“临界剂量”，在高于此“临界剂量”时，癌细胞被杀伤的增加较少，而普通细胞被杀伤的增加较多。

图6.3.5　PAM 的pH 值、H2O2的浓度，以及N和N的浓度之和的变化情况[45]