大气压非平衡等离子体射流生物医学应用实验材料和方法

1.细胞培养

HepG2细胞和L-02细胞都用含10%胎牛血清、100U/mL 青霉素和100 μg/mL链霉素溶液的DMEM 培养基在5% CO2、37 ℃恒温的细胞培养箱中进行培养和传代。实验时分别采用两种细胞单独培养和按一定比例混合后共培养两种培养方式。当采用共培养模式时，需要用活细胞标记试剂盒对HepG2细胞进行荧光标记以区分两种细胞。

2.PAM 制备和细胞处理

图6.3.1　制备PAM 和用PAM 处理细胞示意图[45]

利用N-APPJ制备PAM 和PAM 处理细胞的示意图如图6.3.1 所示。该N-APPJ装置主要由两个同轴的石英管和高压电极组成。外部石英管的外径和内径分别为12mm 和10mm，喷嘴的直径为2mm。内部石英管为单端封口，外径和内径分别为6mm 和4mm。高压电极为一根细铜丝，插入内部石英管中，并通过高压导线与交流电源相连。实验时N-APPJ装置由交流电源驱动，工作电压峰-峰值为15kV，频率为1kHz，2L/min的氦气和10mL/min的氧气混合后作为工作气体，射流喷嘴和液面的距离为10mm。1mL 的完全培养基置于48孔板的一个培养孔中，然后用N-APPJ分别处理5min、10 min、15min。得到不同处理时间的PAM。(www.xing528.com)

在用PAM 处理之前，HepG2细胞和L02细胞单独或者按照1∶3、1∶1和3∶1三种比例接种到96孔板中，等细胞完全贴壁后，用PAM 代替细胞培养基，将单独培养或共培养的两种细胞在PAM 中培养24h后利用荧光显微镜观察两种细胞的贴壁率。

3.检测方法

HepG2细胞和L02细胞在经过PAM 处理后的凋亡情况采用TUNEL法进行检测，采用的试剂盒为原位细胞死亡检测试剂盒（insitucelldeath detectionkit，TMRred），所得结果用荧光显微镜观察记录。

PAM 中H2O2的浓度使用过氧化氢试剂盒进行测量；PAM 中和的浓度之和使用一氧化氮试剂盒进行测量。具体步骤可参考所用相应产品说明书。