不同溶液对HaCaT细胞的毒性比较

图6.2.1给出了HaCaT 细胞在含有不同浓度的和的完全培养基中培养24h后细胞的存活率。

图6.2.1　含有不同浓度的N和N完全培养基对HaCaT 细胞的细胞毒性

n.s.表示无显著性差异，* P＜0.05

由图6.2.1（a）和（b）所示的结果可以看出，不同浓度的溶液和溶液对HaCaT 细胞几乎没有细胞毒性，它们与纯完全培养基对照组没有显著差异。即使当和的浓度分别高达5 mmol/L 和10 mmol/L 时，HaCaT 细胞的存活率依然在90%以上，而5mmol/L和10mmol/L已经比正常应用时PAM 中和的浓度高出了一个量级。图6.2.1（c）所示的结果则进一步表明，和的混合溶液同样不会对HaCaT 细胞造成损伤，它们与纯完全培养基对照组也没有显著差异。

图6.2.2为H2O2及其和的混合溶液对HaCaT 细胞的细胞毒性实验结果。图6.2.2（a）所示结果表明，当细胞培养基中H2O2的浓度低于50μmol/L时，HaCaT 细胞的存活率基本不受影响，但是随着H2O2浓度继续增大，HaCaT 细胞的存活率会显著降低；当H2O2浓度达到400μmol/L时，HaCaT 细胞的存活率已经下降到10%以下。图6.2.2（b）所示结果表明，H2O2溶液中加入后并不会增加对HaCaT 细胞的毒性。图6.2.2（c）所示结果表明，当与混合后，溶液对HaCaT 细胞的毒性会显著增强，可以看到200μmol/L H2O2加上200μmol/L的已经可以导致所有的HaCaT 细胞死亡。顺便指出的是，通常PAM 中H2O2浓度为100～1000 μmol/L。

图6.2.2　H2O2及其和N、N的混合溶液对HaCaT 细胞的细胞毒性实验结果

n.s.表示无显著性差异， *P＜0.05； **P＜0.01；***P＜0.001(www.xing528.com)

进一步地，HaCaT 细胞在经过不同浓度的H2O2溶液单独作用或者与共同作用后，细胞内ROS水平的变化情况如图6.2.3所示。由于在实验中发现，当RONS浓度过高时，HaCaT 细胞在处理后1～2h就会出现收缩和破裂，影响最终的检测结果。因此本实验中细胞内ROS水平在处理后1h就立即测量。由于 和及它们的组合对HaCaT 细胞几乎没有毒性，因此它们对HaCaT 细胞内ROS水平的影响实验时没有测量。

图6.2.3　HaCaT 细胞在用H2O2溶液或H2O2与N混合溶液处理1h后细胞内ROS水平变化情况

由图6.2.3 所示结果可以看出，HaCaT 细胞在经过H2O2单独作用或H2O2和的混合溶液作用后，细胞内ROS水平与对照组细胞相比都有所提高。说明高浓度的H2O2及其和的混合溶液会引起细胞的氧化损伤并最终导致细胞死亡。此外，可以看到当细胞在800μmol/L H2O2及200 μmol/L H2O2+500μmol/L作用时，HaCaT 细胞胞内ROS水平都开始下降，这可能是由于在这两种情况下，由于外源性RONS浓度过高，细胞毒性过强，在测量过程已经有部分细胞开始死亡并从培养孔底部脱落，导致最终ROS的测量结果偏低。

由以上的实验结果可以发现，和作为N-APPJ与液体相互作用过程中产生的两种主要的长寿命活性粒子，当它们的浓度分别低于10mmol/L和5mmol/L时，二者在单独或者共同作用时对HaCaT 细胞几乎都没有细胞毒性。

H2O2作为N-APPJ与液体作用时产生的另一种相对稳定的液相活性粒子，它对HaCaT 细胞的毒性存在着明显的剂量依赖效应。当H2O2的浓度较低时（小于50μmol/L）基本不会对HaCaT 细胞产生毒性。这可能是由于HaCaT 细胞内存在过氧化氢酶，能够将H2O2分解成水和氧气，从而使细胞对低浓度的H2O2有一定的抵抗能力。随着H2O2浓度的增加，外源性的H2O2不能被及时清除，会对HaCaT 细胞造成氧化损伤，严重时直接导致细胞死亡。

当H2O2与混合后对HaCaT 细胞的毒性明显增强，主要是因为二者混合后会生成氧化性更强的细胞毒性氧化剂过氧亚硝酸盐（ONOO-），ONOO-可以穿过细胞膜进入细胞内，对细胞内的靶分子产生很强的毒性作用[28]。