前面几节主要介绍了大气压低温等离子体对小鼠C17.2-NSCs分化的影响，结果表明，等离子体可以有效地促进小鼠C17.2-NSCs向神经元方向的分化，对星形胶质细胞方向的分化无明显影响。这项研究使等离子体应用于神经系统修复成为可能。但是不同的神经干细胞可能对等离子体的敏感性不同，从而造成处理效果的差异。为了明确等离子体对神经干细胞的促分化效果是否具有普适性，本节采用相似的实验方法评估了等离子体对大鼠原代神经干细胞分化的影响。
图4.7.1 大鼠神经干细胞培养[5]
原代神经干细胞从新生SD 大鼠（0～3天）大脑组织中分离培养得到。在SD 大鼠神经干细胞完全培养基（无血清）中培养24h，大部分细胞死亡形成细胞碎片，只有少部分细胞以悬浮形式生长并分裂为几个到几十个细胞的桑葚状细胞团。随着培养时间的延长，克隆球内细胞逐渐增加，到3至4天即可生长为几十到数百个细胞的细胞团，这些克隆球呈悬浮生长，且形态规则、折光性强，细胞活性好，通常把这种球状细胞团称为“神经球”，如图4.7.1（a）所示。这些神经球肉眼可见，在培养基中形成漂浮的小白点。这些神经球若继续培养，则悬浮的神经球继续分裂增大，当神经球增大到一定程度时，球中心的细胞就会因营养不足而停止分裂或凋亡，这种神经球通常周边细胞较亮，而中间细胞因透光率和折光性差而略暗，细胞活性差。因此，在SD 大鼠神经干细胞原代培养过程中应及时对神经球传代，以避免神经干细胞的生长抑制。图4.7.1（b）为传代培养的SD 大鼠神经干细胞。传代后5h观察，发现原代神经球基本被吹散为单个细胞，且该细胞仍然具有继续分裂生成神经球的能力，培养72h即可长成与原代培养相同的悬浮神经球。这里培养的SD 大鼠神经干细胞可传10代左右，但第6到第7代以后的细胞分裂速度明显减慢，且易贴壁、神经球状态不佳，因此本节使用的是6代以内的细胞进行实验。
传代培养获得的神经干细胞球接种于PDL 包被的盖玻片上，贴壁培养24h 后进行Nestin免疫荧光检测。图4.7.2（a）为贴壁培养24h的神经球，可见神经球贴壁后部分细胞逐渐迁出神经球，并呈放射状延伸；图4.7.2（b）中免疫荧光检测发现大部分细胞呈Nestin阳性，表明细胞克隆内主要是Nestin阳性细胞，即神经干细胞。
图4.7.2 大鼠神经干细胞鉴定[5]
实验中给与神经球24h的预分化处理后，细胞被分为3组并给予相应处理：control、He/O2（1%）吹气60s和等离子体处理60s。图4.7.3为分化4天的细胞形态，研究发现等离子体处理组中迁出神经球并呈现分化形态的细胞数目显著增多，呈多分枝的神经样细胞和突起。而He/O2（1%）吹气组与对照组无明显差异。
图4.7.3 大鼠神经干细胞分化的形态学研究[5](www.xing528.com)
图4.7.4中免疫荧光结果证实了上述推论，大鼠神经干细胞培养4天后，大部分细胞发生分化，等离子体处理组中Nestin阳性细胞几乎消失，显著少于对照组和He/O2（1%）吹气组中Nestin阳性细胞的数目。同时，等离子体处理组中β-TubulinⅢ阳性细胞呈现出较对照组更多、更长的神经突，且多分枝，相互交织成复杂的神经网络。在等离子体处理组中O4阳性细胞也显著多于对照组和He/O2（1%）吹气组。
图4.7.4 免疫荧光技术检测大鼠神经干细胞分化4天后
Nestin、β-Tubulin Ⅲ和O4的表达[5]
用Image-ProPlus软件分析免疫荧光结果，统计显示，等离子体处理组中β-Tubulin Ⅲ阳性细胞（神经元）的比例达到了约65%，同时O4阳性细胞（少突胶质细胞）比例约9%，均显著高于对照组和He/O2（1%）吹气组。此外对各处理组中β-TubulinⅢ阳性细胞的平均神经突长度进行统计，等离子体处理组的平均长度达到了650μm，如图4.7.5所示。
上述研究结果均表明，等离子体处理也显著促进了大鼠神经干细胞向神经元的分化，表现为神经元分化比例增多和神经突伸长。等离子体也在一定程度上促进了大鼠神经干细胞向少突胶质细胞方向的分化，但分化比例较低。He/O2（1%）吹气对大鼠神经干细胞的分化无明显影响。
图4.7.5 大鼠神经干细胞分化后定量分析Nestin、β-Tubulin Ⅲ和O4的阳性百分比及神经突长度[5]
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