大气压非平衡等离子体射流促进小鼠C17.2-NSCs分化

在神经系统中，NO 是一种重要的轴突诱导分子，在神经发育与再生过程中发挥着重要的作用。等离子体中包含有各种活性离子，活性离子的组分由放电参数和工作气体决定。本节将利用前文所述实验装置及工作参数，研究等离子体中重要的活性粒子NO 与等离子体促进小鼠C17.2-NSCs分化的关系。首先，将对该放电条件的等离子体光谱进行分析，同时对处理后小鼠C17.2-NSCs细胞内和培养基中（外液）中的NO 浓度进行监测，以确定NO 是否参与了等离子体促进小鼠C17.2-NSCs分化的过程；接着用NO 供体和NO清除剂等对小鼠C17.2-NSCs细胞进行相关干预，以明确NO 与等离子体促进小鼠C17.2-NSCs分化的关系。

利用前文所述的细胞内和细胞外NO 检测方法，对不同时间点（等离子体处理后立即检测、培养2天、4天和6天）小鼠C17.2-NSCs细胞内和培养基中的NO 浓度进行了检测。如图4.5.1所示，等离子体处理后细胞外液的NO浓度达到了83nmol/mL，而对照组和He/O2吹气组的NO 浓度非常低，几乎难以检测到。推测等离子体中的NO 粒子扩散到了培养基中，引起了细胞外液NO 浓度的升高，该细胞培养微环境的改变可能是造成小鼠C17.2-NSCs细胞分化的直接原因。但是，等离子体处理并未引起细胞内NO 浓度的瞬时升高，可能是由于给以不同组的处理时间只有60s，且处理后立即进行细胞内NO 浓度检测，而NO 进入细胞并与细胞内超氧离子等作用生成硝酸盐和亚硝酸盐的过程相对缓慢（由于检测方法的限制，通过检测细胞内硝酸根和亚硝酸根的量来间接反应NO 的浓度）。同时检测培养2天、4天和6天的细胞内和细胞外NO 浓度，发现等离子体处理组培养2天的细胞外液中NO 浓度较低，但随着培养时间的延长，NO 浓度开始逐渐升高，分析原因可能是NO 的半衰期很短，且培养2天时细胞内调控NO 产生的机制并未完全启动；随着培养时间的延长，细胞内逐渐出现完善的NO 合成和调控机制，继而引起细胞外液NO 的升高。细胞内NO 浓度检测证实了上述推测，即等离子体处理组中NO浓度随着培养时间的延长逐渐升高，表明小鼠C17.2-NSCs受到等离子体的作用，逐渐启动细胞内NO 合成机制。

图4.5.1　NO 浓度检测[5]

为了进一步验证上述推论，检测了细胞内与NO 合成相关的iNOS的表达。如图4.5.2 所示，等离子体处理组中iNOS 的表达显著高于对照组和He/O2吹气组，且随着培养时间的延长，其诱导表达量逐渐增多。

上述结果说明，等离子体不仅作为NO 供体发挥作用，且调控了细胞内NO 的合成（iNOS的表达），即NO 可能是等离子体促进小鼠C17.2-NSCs分化的关键因子。

为了进一步确认NO 是等离子体促进小鼠C17.2-NSCs分化的关键作用因子，本实验研究了NO 清除剂（Hgb）对等离子体促进小鼠C17.2-NSCs分化的干预作用。有大量研究报道，NO 供体可以促进神经干细胞的分化，因此实验中同时还比较了SNP（NO 供体）和等离子体对小鼠C17.2-NSCs分化的作用（见图4.5.3）。

图4.5.2　等离子体处理对C17.2-NSCs细胞分化过程iNOS表达的影响[5](www.xing528.com)

图4.5.3　NO 清除剂拮抗等离子体对小鼠C17.2-NSCs的促分化作用[5]

细胞被分为8组：无处理对照组、He/O2吹气组、等离子体处理组、SNP处理组（100μmol/L，NO供体）、Hgb处理组（20μmol/L，NO 清除剂）、Hgb和He/O2吹气共同处理组、Hgb和等离子体共同处理组、Hgb和SNP共同处理组

对8个不同处理组的细胞形态学观察发现：在无Hgb预处理时，与对照组相比，等离子体和SNP 处理组细胞均有更多、更长的神经突。这说明等离子体和SNP的作用类似，均可以促进小鼠C17.2-NSCs细胞的分化。然而，这种作用明显地被Hgb 处理所抑制，Hgb 和等离子体共同处理组（plasma+Hgb）及Hgb和SNP共同处理组（SNP+Hgb）细胞均表现出和对照组相似的效果，细胞无明显的分化形态。He/O2吹气组与对照组无明显差异。

检测8个不同处理组中NO 的浓度，发现等离子体处理组和SNP处理组中具有较高的NO 浓度；然而Hgb和等离子体共同处理组（plasma+Hgb）及Hgb和SNP共同处理组（SNP+Hgb）中NO 浓度较低。这说明Hgb有效地清除了等离子体和SNP 产生的NO，这应该是Hgb 拮抗等离子体对小鼠C17.2-NSCs的促分化作用的直接原因。

上一节的结果表明，等离子体主要促进了小鼠C17.2-NSCs向神经元方向的分化。因此，本实验还检测了各处理组中不成熟神经元标记蛋白β-TubulinⅢ和成熟神经元标记蛋白NF200的表达。与上述结果相同，等离子体和SNP均明显地促进了神经元的分化和成熟，然而Hgb有效地拮抗了这种作用。

综上所述，NO 清除剂可以有效地拮抗等离子体对小鼠C17.2-NSCs的促分化作用，这说明NO 是等离子体促进C17.2-NSCs分化的关键作用因子。