细胞周期是指细胞从上一次分裂结束到下一次分裂结束的过程，由G1期、S期、G2期和M 期组成。正常的真核细胞周期中主要有四个检验点，分别是G1/S期检验点、S期检验点、G2/M 期检验点和M 期检验点，细胞周期在这几个检验点的共同监测下周而复始地进行[22]。细胞周期调控机制紊乱是细胞增殖失控和导致细胞癌变的重要原因，是肿瘤细胞的基本特征之一。因此抑制肿瘤细胞周期的进行也将成为肿瘤治疗的一种重要潜在策略[23]。前面几节探讨了大气压非平衡等离子体射流诱导的细胞凋亡并从等离子体引起的硝化/氧化应激、内质网应激和线粒体凋亡途径等角度讨论了其凋亡诱导机制。本节通过对等离子体处理后的细胞周期进行分析，同时分析细胞周期调控的关键酶及蛋白，阐明了等离子体阻滞细胞周期进行的机制。
HepG2细胞经等离子体处理后，收集各组细胞，分别经过固定和PI染色后，使用流式细胞仪检测每个细胞周期中的细胞分布情况。由于PI可以与细胞的染色质特异性地结合，可以通过流式细胞术检查细胞内的PI荧光，从而检查细胞内DNA 的含量（横坐标），并统计DNA 含量不同的细胞数（纵坐标），并计算其在细胞总数中的比例。细胞在G1期时，DNA 复制还没有开始，也是DNA 含量最少的，即流式检测结果图的第一个峰；细胞进入S期后，细胞开始复制，到完成复制，是一个一倍DNA 到二倍DNA 的过程，在流式分析结果图中显示S期跨度特别大（第二个不高但很宽的峰）；当细胞完成DNA 复制后就进入了G2期，此时细胞内的DNA 复制完成至分裂的一段时间，细胞内含二倍DNA，即流式结果图中的第二个峰；但是细胞处于M 期时，此时细胞内也是二倍DNA，用DNA 含量的方法是无法与G2期分开，所以在流式的结果图上，通常表示为G2/M 期。
结果如图3.6.1所示。当等离子体处理剂量达到240s并且继续培养24h后，G2/M 期的细胞量有了明显的增加。当等离子体处理达到480s时，G2/M 期的细胞量从13.4%增加到了49.6%，此时已经出现了sub-G1期，即有凋亡的细胞。当细胞继续培养到48h，凋亡的细胞更是增加到了33.35%。这也说明了等离子体对细胞的增殖有抑制作用，同时伴随着细胞周期的G2/M 期阻滞[10]。
图3.6.1 等离子体对细胞周期分布的影响[10]
（a）、（b）、（c）：HepG2 细胞分别经0s、240s和480s等离子体处理后，继续培养24h检测；（d）、（e）、（f）：HepG2 细胞分别经0s、240s和480s等离子体处理后，继续培养48h检测
续图3.6.1
为了进一步研究等离子体对细胞周期G2/M 期阻滞的分子机制，通过RT-PCR 和WesternBlot法分别对参与细胞周期调控的细胞周期蛋白依赖性激酶（cyclin-dependentkinase，CDK）和细胞周期蛋白（cyclin）进行了检测。RT-PCR 结果如图3.6.2所示，随着等离子体处理时间的增加，细胞内CDC2和CyclinB1的mRNA 水平明显降低，这说明等离子体对细胞周期的阻滞与CDC2和CyclinB1转录水平的降低有关；同时，对CDK 抑制因子P21和肿瘤抑制因子P53的RT-PCR 检测发现，随着等离子体处理时间的增加，P21 和P53的mRNA 水平明显上升，表明P21 和P53 也参与到了等离子体诱导的HepG2细胞周期阻滞和凋亡过程中。和RT-PCR 结果类似，如图3.6.3 所示，随着等离子体处理时间的增加，CDC2和CyclinB1蛋白的表达量逐渐减少，而P21和P53的表达量有所增加，表明等离子体对Hep G2细胞的周期阻滞与CDC2和Cyclin B1蛋白的表达量有关，同时还要受到P21和P53蛋白的调控。同时，对Cyclin A的分析表明，Cyclin A的蛋白表达没有明显受到等离子体处理的影响。Cyclin A是细胞S期行进过程中不可缺少的一种周期蛋白，与DNA的复制密切相关，这也说明等离子体对G2/M 期的抑制作用是特异性的[10]。(www.xing528.com)
图3.6.2 等离子体对HepG2细胞周期相关基因表达的影响[11]
*P＜0.05，** P＜0.01和无处理对照组相比；n=3
续图3.6.2
图3.6.3 等离子体对HepG2细胞周期相关蛋白的影响[11]
*P＜0.05，** P＜0.01，***P＜0.001和无处理对照组相比；n=3
免责声明：以上内容源自网络，版权归原作者所有，如有侵犯您的原创版权请告知，我们将尽快删除相关内容。
