大气压非平衡等离子体射流：生物医学应用

前面主要探讨了等离子体引起的细胞内氧化/硝化应激及下游的线粒体凋亡通路的激活与肿瘤细胞凋亡的关系。另一方面，有研究表明，细胞内氧化与抗氧化状态的失衡可以直接或间接地影响内质网的稳态，导致内质网应激发生[18]。因此在本小节中将主要讨论内质网应激与大气压非平衡等离子体射流诱导HepG2细胞凋亡的关系[14]。

图3.5.13　等离子体对HepG2细胞Bcl-2和Bax蛋白的影响[11]

*P＜0.05，** P＜0.01，***P＜0.001和无处理对照组相比；n=3

图3.5.14　等离子体对细胞caspase3、caspase8、caspase9相对活性的影响[11]

*P＜0.05，** P＜0.01，***P＜0.001和无处理对照组相比；n=3

细胞内的钙稳态对于维持细胞的正常功能非常重要，如蛋白质折叠、加工、转运及信号转导等。内质网是细胞内最主要的钙库，对于维持细胞内的钙稳态非常重要，内质网应激的发生通常会伴随细胞内钙稳态的破坏，导致内质网中钙的外溢和细胞质内自由钙离子浓度的升高[19]。采用Fluo-3AM 探针可以检测等离子体处理后HepG2细胞内钙稳态的变化。Fluo-3AM 是一种常用的钙离子探针，它本身荧光非常弱，进入细胞后可以被酯酶剪切为Fluo-3滞留在细胞内，与细胞内的Ca2+结合产生较强的荧光，利用荧光酶标仪或者流式细胞仪可以检测到Ca2+的荧光。结果如图3.5.15所示，240s等离子体处理组、480s等离子体处理组和720s等离子体处理组中，Fluo-3阳性细胞比例分别为22.2%、35.18%和39.46%，显著高于无处理对照组（4.41%）。这说明在等离子体处理组中HepG2细胞内积累了大量的自由Ca2+离子，即等离子体处理破坏了HepG2细胞的钙稳态，这预示着HepG2细胞内质网应激的发生。(www.xing528.com)

图3.5.15　等离子体处理对HepG2细胞内钙稳态的影响[14]

内质网内环境的稳定是实现内质网功能的基本条件，但是有非常多的因素可以造成内质网稳态的破坏，如细胞内Ca2+平衡的紊乱、氧化应激等，继而引发内质网应激[20]。内质网应激是一个适应性机制，其目的是减轻或终止外界刺激造成的内环境稳态的破坏；然而持续的外界刺激通常会诱发内质网应激介导的细胞凋亡[21]。下面通过WesternBlot方法对内质网应激途径中的关键蛋白进行了检测，所得结果如图3.5.16 所示，等离子体处理可以造成HepG2细胞内pro-caspase12水平的下调，这暗示细胞内caspase12的活化。同时，在等离子体处理组中，还检测到了caspase9 和caspase3 的活化（cleaved-caspase9和cleaved-caspase3的上调）。研究结果表明，pro-caspase 12只有在内质网应激发生时才可被特异性的水解活化，而活化的caspase12切割caspase9酶原，继而裂解caspase3酶原等，引发caspase级联反应，导致细胞凋亡的发生。Caspase12的活化及下游caspase级联反应预示了等离子体处理后HepG2细胞内质网应激的发生。GRP78和CHOP是内质网应激发生时细胞内重要的下游蛋白，执行内质网应激介导的细胞凋亡的发生。等离子体处理还造成了HepG2细胞内GRP78和CHOP的表达上调，并呈等离子体剂量依赖效应。上述实验结果均表明，等离子体还可通过引发内质网应激介导HepG2细胞的凋亡。

图3.5.16　等离子体处理对HepG2细胞内内质网应激相关蛋白表达的影响[14]

综上，等离子体中的ROS和RNS均为高反应活性物质，其寿命很短，可迅速通过主动输运或扩散的方式进入细胞膜生成相对稳定的氢过氧化物或过氧亚硝酸盐阴离子（ONOO-）。同时大气压非平衡等离子体射流处理进一步促进iNOS的表达和NOS活性的提高，继而催化合成大量的NO。另外，细胞遭受外界等离子体刺激时，有氧呼吸链也会释放ROS至细胞内。等离子体中的ROS和RNS以及次生的ROS和RNS，会攻击细胞内底物（如蛋白质等），造成蛋白质的硝基化和羰基化损伤，影响蛋白质的功能。这些受损或错误折叠在蛋白质会在内质网中积累，引发错误折叠蛋白质反应，破坏内质网内环境稳态，继而引发内质网应激介导的细胞凋亡。ROS和RNS作为细胞凋亡线粒体通路的重要诱导因子之一，也会通过抑制凋亡抑制蛋白Bcl-2的表达，促进促凋亡蛋白Bax的表达，从而启动线粒体凋亡信号通路。抗氧化剂NAC预处理可拮抗等离子体诱导的HepG2细胞凋亡。因此，ROS和RNS确实是等离子体诱导HepG2细胞凋亡的关键作用因子。通过调节等离子体放电参数，以调控所产生等离子体的活性粒子（如ROS和RNS）的成分和剂量，是未来实现等离子体高效、可控用于癌症治疗的关键途径。