AnnexinV 是一类Ca2+依赖性的磷脂结合蛋白，可高亲和力地与细胞膜上的PS结合。碘化丙啶（propidium iodide，PI）是一种大分子的DNA 染料，可以与DNA 链结合激发红色荧光。在正常细胞中，PS分布在细胞膜磷脂双分子层的内侧。在早期凋亡的细胞中，细胞膜上的PS会外翻，使得PS暴露于细胞表面，而此时细胞膜完整，PI染料不能进入细胞膜而结合DNA 链；在晚期凋亡或坏死细胞中，不仅会出现PS外翻，且细胞的细胞膜完整性丧失，PI染料可以自由进入细胞而与DNA 分子结合，呈现红色荧光；坏死细胞由于细胞膜完全破坏，故仅有DNA 双链与PI结合后PI激发的红色荧光。根据此特性，可以使用标记了FITC的AnnexinV（绿色）和PI（红色）作为荧光探针，标记细胞后进行流式细胞术检测，根据细胞内荧光强度的不同将正常、坏死、晚期凋亡、早期凋亡的细胞区分开。在流式结果图中，细胞被分为四个象限，其中，左上象限为坏死细胞（AnnexinV 阴性/PI阳性），右上象限为凋亡晚期细胞（Annexin V 阳性/PI阳性），左下象限显示活细胞（Annexin V 阴性/PI阳性），右下象限为早期凋亡细胞（Annexin V 阳性/PI阴性）。
从图3.4.4中可以看出，与无处理的对照组相比，随着等离子体处理时间的增加，细胞凋亡率明显上升（早期凋亡和晚期凋亡），并呈现出典型的等离子体剂量依赖效应。当等离子体处理时间达到960s时，早期凋亡和晚期凋亡的细胞比率分别达到了22.2%和15.0%。此外，处于左上象限的细胞百分比很低（小于4.5%），属于正常误差范围。这表明，等离子体可以有效地诱导HepG2细胞凋亡，而不是坏死，这对于等离子体的临床应用是十分有利的。
接下来进一步检测大气压非平衡等离子体射流处理对人正常肝细胞L02的凋亡诱导作用。如图3.4.5所示，大气压非平衡等离子体射流处理720s仅诱导7.1%（5.1%+2.0%）的L02细胞发生凋亡；而从图3.4.4可看出，相同剂量的大气压非平衡等离子体射流处理可诱导24.5%（10.6%+13.9%）的HepG2细胞发生凋亡。这说明，人正常肝细胞L02对于等离子体的敏感性较差，暗示等离子体诱导凋亡作用具有选择性，这对于癌症治疗具有非常重要的临床意义。
在本节中，采用细胞形态观察、Hoechst33342染色、JC-1探针染色评估了一系列凋亡生理特征，发现大气压非平衡等离子体射流处理可以造成HepG2细胞皱缩、染色质凝集以及线粒体膜电位的改变，这些均暗示了细胞凋亡的发生。值得注意的是，Hoechst33342染色观察凋亡细胞核，480s等离子体处理组中HepG2细胞呈现出典型的凋亡细胞核形态，而人正常肝细胞L02中有较少的细胞呈现这种形态。用AnnexinV-FITC/PI进一步比较等离子体对人肝癌细胞HepG2和人正常肝细胞的L02的凋亡诱导效果，发现120s的大气压非平衡等离子体射流即可有效地诱导HepG2 细胞的凋亡；当处理时间为960s时，HepG2细胞的凋亡率可以达到37.2%，显著高于对照组。此外各处理组中几乎没有坏死的发生，说明等离子体可以诱导癌细胞的凋亡，而不是坏死，这样可以避免炎症的发生，具有十分重要的临床意义。等离子体可以有效地诱导HepG2细胞凋亡，而对人正常肝细胞L02的毒性较小，等离子体的诱导凋亡作用有“选择性”。这项研究为等离子体应用于临床癌症治疗提供理论支持。
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图3.4.4 AnnexinV-FITC/PI双染检测大气压非平衡等离子体射流诱导的HepG2细胞凋亡[11]
图3.4.5 AnnexinV-FITC/PI双染检测大气压非平衡等离子体射流诱导的L02细胞凋亡[12]
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