大气压非平衡等离子体射流对质粒DNA的生物医学应用

质粒是染色体外的一种双链、闭环的DNA 分子，并以超螺旋状态存在于宿主细胞中，它具有自主复制和转录能力，能在子代细胞中保持恒定的拷贝数，并稳定表达所携带的遗传信息，因此被广泛应用在分子生物学和基因工程研究中。通过研究大气压非平衡等离子体射流对pAHC25 质粒DNA的作用，将能反映出大气压非平衡等离子体射流对遗传物质的破坏作用，进而为大气压非平衡等离子体射流诱导癌细胞凋亡的机制研究提供必要的实验基础。

这里采用的等离子体射流装置示意图如图3.2.1所示[9]，它由内外双层空心石英玻璃管制成，外层石英管长约5cm、内径约6mm，石英管的一端通入气体，另一端喷出等离子体，等离子体出口直径约1.2 mm；高压脉冲电源的正极通过2mm 直径的铜导线接入单端封口的内层石英管中，内层石英管长4cm，外径为4mm；内层毛细石英管固定于外层石英玻璃管的中央，封口端距喷嘴约1cm。该等离子体射流采用8kV，8kHz，脉宽为1.0μs的脉冲电源驱动，工作气体比例为 He∶O2=1∶0.01。当该射流装置通入一定流速的氦氧混合气体，同时打开高压脉冲电源，等离子体就能从射流装置的喷嘴处喷出。质粒溶解于60μL去离子水中，浓度为0.1μg/μL，短暂离心到EP管底部用于处理。

图3.2.1　pAHC25质粒处理实验装置示意图[9]

用大气压非平衡等离子体射流处理各组中的质粒，按时间梯度分为10s、30s、1min、2min、4min、8min、16min，每个时间梯度处理1个EP管的质粒DNA，同时取1组质粒不做任何处理，作为无处理对照组。关上电源用相同流量的气体分别处理10s、4min、16min，作为气体对照组。喷嘴与EP 管口的距离为5 mm，距质粒DNA 液面45 mm。等离子体处理完成后进行0.7%琼脂糖凝胶电泳检测。

处理结果如图3.2.2及图3.2.3所示，pAHC25质粒DNA 经过等离子体处理后，随着处理时间的增加，超螺旋构象的部分逐渐减少，而线性和开环构象的质粒逐渐增加。对于未处理对照组和气体处理组，质粒都是以超螺旋构象存在的。如图3.2.2中泳道1～5所示，当处理时间达到4min时，超螺旋部分的质粒完全消失（泳道5）。当处理时间大于8min时，质粒完全变成了碎片（泳道6和7）。为了进一步研究质粒构象变化与等离子体处理时间的关系，分别用等离子体处理质粒5min、6min和7min，结果如图3.2.3所示。当用等离子体处理达到5 min 时，线性和开环构象的质粒变得越来越明显，如图3.2.3中泳道2所示，随着处理时间的继续增加，条带强度逐渐变暗，同时逐渐变得弥散，表明DNA 逐步地分解。

为了进一步研究等离子体对质粒DNA 上所携带基因的影响，下面首先使用胶回收试剂盒对质粒的琼脂糖凝胶电泳条带进行了纯化，并分别分离得到了超螺旋、线性和开环构象的质粒，作为PCR 基因扩增的模板，对pAHC25质粒上所携带的bar（图3.2.4（a））、ubi-promoter（图3.2.4（b））和gus（图3.2.4（c））基因进行PCR 扩增，结果表明，经等离子体处理5min后，质粒上所携带的基因并没有明显的缺失。

图3.2.2　等离子体对质粒构象的影响[9](www.xing528.com)

1～7：等离子体处理10s、30s、1 min、2min、4min、8min和16min；8～10：气体处理对照组；11：无处理对照组；12：DNA MarkerDL10000；a：超螺旋构象质粒；b：开环构象质粒；c：线性构象质粒；d：DNA 碎片

图3.2.3　等离子体对质粒构象的影响[9]

1～4：等离子体分别处理1min、5min、6min和7min；5：气体处理对照组；6：无处理对照组；7：DNA MarkerDL10000；a：超螺旋构象质粒；b：开环构象质粒；c：线性构象质粒；d：DNA 碎片

图3.2.4　对bar、ubi-promoter和gus基因的PCR 扩增结果[9]

1：使用未处理的pAHC25质粒做模板；2：使用等离子体处理5min但未纯化的pAHC25质粒做模板；3：使用纯化的开环构象的pAHC25做模板；4：使用纯化线性构象的pAHC25质粒做模板；5：同时使用纯化的开环和线性构象的pAHC25做模板；6：DNA markerⅢ

综上所述，一定量的等离子体处理能够造成质粒DNA 的损伤，从而改变了其构象，但是对质粒上所携带的基因没有明显的影响。而高剂量的等离子体处理将直接导致质粒DNA 完全降解。另一方面，DNA 的损伤是凋亡细胞的一个重要特征，这为等离子体抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡的研究提供了一些启发和研究思路。