1.PARAO 的制备
紫草油中的紫草素是一种有较强脂溶性的萘醌类化合物，呈紫红色，具有抗炎、抗菌、抗癌等作用，也是紫草油中的主要有效成分。其含量可通过紫外-可见分光光度法测定。采用与2.2.1节相同的N-APPJ装置直接处理紫草油（RAO）。该装置使用交流电源驱动，电压峰-峰值为24kV，频率为10kHz。所用工作气体为Ar+10%O2，气体流量为0.5L/min。图2.6.10（a）给出了N-APPJ处理紫草油的示意图。处理时，首先在反应容器中加入100g紫草油。然后用N-APPJ装置的末端喷嘴置于油面以下2mm 的位置放电处理1～24h。图2.6.10（b）为等离子体处理紫草油的瞬态照片。由于气流的注入，使得油中形成了不稳定的空腔，气体在空腔内的放电是以射流形式，以及空腔内表面沿面放电共同组成。这与2.6.1节所述的N-APPJ处理活化油的瞬态过程一致。图2.6.10（c）为未处理的紫草油和经N-APPJ处理完毕的紫草活化油的照片。从外观上，两者近乎没有差别。
PARAO 抗菌活性评估方法与前面相同。采用铜绿假单胞菌和MRSA 进行菌液制备。然后在20个琼脂平板分别接种铜绿假单胞菌（105CFU/mL）和MRSA 菌液（106CFU/mL）。之后将直径为6mm，含有100mgPARAO 或RAO 的滤纸盘放置在琼脂表面，并将培养基置于37 ℃培养箱中培养12h。培养结果如在滤纸盘周围有可见的抑菌环，则表明PARAO或RAO 对铜绿假单胞菌和MRSA 有抗菌活性。然后测量抑菌圈的直径。每组实验重复6个样本。
图2.6.10 N-APPJ活化紫草油[82]
（a）N-APPJ处理紫草油示意图；（b）N-APPJ处理紫草油的瞬态照片；（c）未处理的RAO 和经8hN-APPJ处理的PARAO 照片
2.PARAO 主要参数检测结果
图2.6.11（a）为PARAO 的过氧化值和紫草素吸光度随处理时间的变化，其中，0h的值代表未经处理的紫草油。在N-APPJ处理前8h，过氧化值的增加较为明显，从最开始的4meq/kg增加到300meq/kg。此后，过氧化物增加幅度放缓。PARAO 的紫外吸光度结果表明，紫草素浓度在0～8h内仅下降5.4%，而处理24h紫草素浓度下降34.5%。因此，等离子体处理引起的紫草素的减少是有限的，尤其是N-APPJ处理8h内，紫草素含量变化不大，这与图2.6.10（c）给出的RAO 和PARAO 的颜色是一致的。尽管较高的过氧化值可以促进灭菌，然而，尽可能高的紫草素可以维持RAO 的基本功能。因此，下面的实验均使用8hN-APPJ处理的PARAO 来研究其灭菌效果和对烧伤创面的愈合效果。
如图2.6.11（b）所示，随着处理时间的增加，PARAO 的碘值从123g/100g降低到67g/100g。不饱和程度降低，这表明 C= C 双键被等离子体中的高能粒子打开，形成了活性物质。图2.6.11（c）中可以看到随着等离子体处理时间的增加，PARAO 的酸值从4.8 mg/g增加到13 mg/g，由2.6.1节可知，这是羧酸产生导致的结果。
图2.6.11 PARAO 的过氧化值、表征紫草素含量的紫外吸光度、碘值和酸值随N-APPJ处理时间的变化[82]
通过对比RAO 和PARAO 的FTIR 结果（图2.6.12）可以看出，C = C（1656cm-1）和 = C—H（3009cm-1）的透光率减小，而C—O（1105cm-1、1170 cm-1）、C = O（1746cm-1）和O—H（3474cm-1）的透光率显著增加[89]。由于RAO 的主要成分是芝麻油，其主要的不饱和脂肪酸包括具有三个 C= C双键的亚麻酸、具有两个 C= C双键的亚油酸和具有单个 C= C 双键的油酸。等离子体-油交界面处的放电进一步增强了这些不饱和脂肪酸的分解和氧化。C =C展宽和 =C—H 展宽的减少，以及C—O、C =O 和O—H 展宽振动的增加，表明等离子体中的高能活性粒子对 C =C双键进行了解离和氧化，其中主要产物为羧酸和H2O2。这与等离子体活化油的产生机制相同，也是其作用皮肤创面时的主要活性物质。
图2.6.12 PARAO 和RAO 的FTIR 结果对比[82]
3.PARAO 的杀菌效果(www.xing528.com)
图2.6.13 PARAO 及RAO 处理MRSA、铜绿假单胞菌的实验结果[82]
（a）、（b）MRSA；（e）、（f）铜绿假单胞菌；（c）、（g）空白对照组；（d）、（h）采用头孢他啶处理的阳性对照组
由于烧伤创面经常会受到MRSA 以及铜绿假单胞菌等细菌的感染，因此，下面研究了PARAO 对体外MRSA 以及铜绿假单胞菌的抗菌活性。如图2.6.13所示，培养结果表明，相比较RAO 以及对照组，PARAO 对MRSA 和铜绿假单胞菌具有很强的抗菌作用。其中，PARAO 处理MRSA 的抑菌环直径为（1.35±0.25）cm，而由RAO 处理下方仍存在少量菌落，说明RAO 的灭活作用较弱。由2.6.1节可知，这主要是由于高浓度的过氧化氢以及羧酸的作用。进一步比较发现，PARAO 对MRSA 的灭活效率要高于铜绿假单胞菌，并且优于PAO 处理MRSA 的结果（约1.1cm），这说明了药物增强型的PARAO 具有更好的杀菌效果。阳性对照组头孢他啶的灭菌效率远高于等离子体活化紫草油，其对MRSA 和铜绿假单胞菌的抑菌环直径分别为（4±0.3）cm 和（6±0.5）cm，如图2.6.13（d）和（h）所示。
4.PARAO 的伤口愈合效果
图2.6.14（a）给出了PARAO 处理小鼠烧伤创面后的愈合情况。相比较空白对照组（无任何处理）和RAO 组，采用N-APPJ处理的活化紫草油可以显著加速小鼠烧伤创面的愈合。由于免疫系统自身造成的炎症反应，烧伤创面早期会出现水肿，表现为伤口区域面积扩大。然而，图2.6.14（a）显示第3天PARAO 组的伤口扩展明显低于其他两组，这说明PARAO 能够减轻这种由于炎症反应造成的水肿现象。在通过PARAO 治疗5天后，伤口减小到初始伤口大小的（84.2±5.3）%，情况明显好于RAO 组的伤口（98.3±6.3）%；而空白对照组中伤口仍然处于水肿状态，其大小为初始伤口的（110.2±7.3）%；除了能够减轻水肿以外，PARAO 组相比其他组能够更早地出现再上皮化，肉芽组织也更加完整。在第14天，PARAO 组的伤口已完全闭合，而此时空白对照组和RAO 组的伤口闭合率仍只有77%和89%。RAO 组和空白对照组的伤口分别在第16 天和第19 天闭合。由于检测结果已表明N-APPJ处理（8h）对紫草素的影响很小。因而，PARAO 不仅保留了RAO 促进伤口愈合的能力，还能产生高浓度的H2O2和羧酸来进一步增强其活性，从而加快了伤口愈合。
进一步对伤口切片进行了免疫组化分析。图2.6.15为H&E 染色照片。第1天中三组样本的组织切片显示，全部表皮和部分真皮层受到损伤，并且发生了水肿，而更深处的筋膜和肌肉组织并未损伤，说明伤口均为Ⅱ度烫伤。到了第7 天，可以发现三组均出现了再上皮化，但PARAO 组中的上皮组织更加平滑、成熟，与真皮层间的边界更清晰；而RAO 组中纤维蛋白凝块仍保留在伤口上。在整个治疗期间，PARAO 组的再上皮过程也较RAO 组更快。在第14天，可以观察到PARAO 组的肉芽组织成熟度和表皮层结构均优于其他两组，且出现了毛囊结构等皮肤附属物，具有与正常皮肤相似的组织学和形态，伤口区域完全再生；而此时在空白对照组中仍观察到淋巴细胞和中性粒细胞浸润。综上，PARAO 组比其他两组表现出了更轻的炎症反应，更快速以及更优秀的再上皮化过程。
图2.6.14 PARAO 及RAO 处理小鼠烧伤创面后的愈合情况和统计结果[82]
胶原蛋白是皮肤的主要成分，通过提供组织强度和细胞外基质框架来促进细胞黏附和迁移，因而在组织愈合中非常重要。胶原蛋白也是影响疤痕愈合的关键因素之一，过度炎症和胶原蛋白的不成熟会引起的疤痕皮肤具有明显不同于正常皮肤的胶原蛋白模式。图2.6.16进一步给出了伤口组织切片的MT 染色照片。可以看出，在整个伤口愈合的过程中，PARAO 治疗组的切片具有更快速的胶原沉积以及更整齐的连续胶原蛋白排列，并且其状态也最接近正常皮肤。
图2.6.15 PARAO、RAO 处理以及对照组第1、第3、第7和第14天的伤口组织H&E染色图像[82]
图2.6.16 PARAO、RAO 处理以及对照组第1、第3、第7和第14天的伤口组织MT 染色图像[82]
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