大气压非平衡等离子体射流灭活致病真菌

前面主要介绍了N-APPJ作用口腔内两种代表性细菌及其生物膜的灭活研究。然而，除了细菌之外，口腔内还存在有典型细胞核和完善细胞器的真核微生物。白色念珠菌就是一种典型的真菌病体，在口腔可引起急性或者慢性口腔假丝酵母菌病等[72，73]，因而同样是口腔内重要致病菌之一。基于此，本节将介绍N-APPJ针对白色念珠菌的灭活研究。

首先按照标准方法培养白色念珠菌菌液，使用比浊仪将菌液浓度调至0.5麦氏浓度（1.5×108 CFU/mL），然后将标准液稀释至106 CFU/mL 备用。实验时使用接种棒将菌液均匀涂布于无菌的沙保培养基中，之后进行等离子体处理。

等离子体装置与2.2.1节的相同。采用脉冲直流电压驱动，电压幅值、脉冲频率及宽度分别为8kV、8kHz以及1600ns。所用工作气体为He+3% O2，流速为2L/min。实验装置示意图及等离子体处理真菌的照片如图2.4.1所示。

实验分为两组，一组为不加盖处理组，其菌样直接暴露在大气环境中，如图2.4.1（a）所示。而图2.4.1（b）中，培养皿则被加盖，仅在盖子中心位置开了一个射流直径相同的小孔（大约5mm），以保证射流能够接触真菌。喷嘴与样品表面间的距离约为8mm。两组实验各包含5个样本，其中4个样本分别被等离子体处理2min、3.5min、5min和8min，另外一个样本作为对照。图2.4.1（c）和（d）给出了N-APPJ处理的实物图。由图2.4.1（d）可知，当空气进入培养皿的通道受到限制时，N-APPJ的发光强度会大幅降低。

图2.4.2和图2.4.3分别给出了N-APPJ处理后的白色念珠菌（培养24h后）的照片对比图以及白色念珠菌的存活率曲线图。从这两个图可以看出，随着处理时间的增加，白色念珠菌的存活率逐渐降低，且白色念珠菌存活数目与培养皿加盖与否密切相关。在无盖条件下，即使经过8min长的N-APPJ处理，也仅有约50%的真菌被有效灭活；而当对培养皿加盖处理，仅3.5min就有超过99.9%的白色念珠菌被灭活。经过计算发现，在加盖条件下，单位菌落的细菌数目要比无盖条件下少四个数量级。

进一步由图2.4.2可知，当培养皿不加盖时，由于没有培养皿盖的限制作用，等离子体有效作用区域非常有限，其作用半径随处理时间逐渐增加。而在加盖条件下，等离子灭活范围则均匀囊括了整个培养基表面。这与2.3节所述的结论是一致的。

图2.4.1　实验装置示意图及等离子体射流处理照片[74]

图2.4.2　加盖和不加盖条件下等离子体处理白色念珠菌的灭活效果[74]

（a）～（e）为加盖；（f）～（j）为不加盖

图2.4.3　加盖和不加盖条件下N-APPJ处理白色念珠菌存活率曲线[74](www.xing528.com)

由于气流为2L/min，喷嘴内径为1.2mm，可以计算出气体流速约为30 m/s，因此活性粒子到达培养皿边缘所需的最短时间约为1ms。而如果根据气体扩散速度近似计算，该时间则需要10ms以上。由于O 原子可能在白色念珠菌的失活过程中起重要作用，下面首先分析了O 原子的寿命。由2.2节可知，O 的寿命与O、O2的复合以及与O3分子的复合、分解有关。Waskoenig等通过模拟研究了射频驱动大气压微等离子体射流中O 原子的形成机理，结果表明，N-APPJ核心中的O 原子浓度约为1015cm-3，并沿气流流出方向急剧下降[75]。Park等人使用He+O2大气压等离子体全局模型计算了O 原子和O3分子的密度，结果表明，当仅使用0.5%的O2混合气时，气体混合物中O2的分压会严重影响O 原子和O3分子的密度，使其达到峰值1016cm-3，当O2的分压进一步增加时，O 原子和O3分子的密度开始降低[76]。因此，不加盖时O 的寿命可能较短，无法作用于培养皿边缘，因而导致了图2.4.2（b）～（d）所示的处理效果；而加盖时，培养皿内O2的浓度低，O 的寿命会明显增加，导致它能够到达培养皿的所有区域。另外，更重要的是，有盖时，寿命长的活性粒子在培养皿内的时间远高于无盖时的情况。因为不加盖时，气流与培养皿接触后立刻往上流动而不再与培养皿接触。

此外，在图2.4.2中还观察到一个有意思的现象，即对于He+3%O2射流处理中心区域的毫米范围内，真菌似乎相对受影响较小，而对于纯He等离子体则未出现上述现象。这可能是由于气流中重粒子，如O2的推动作用，使得细胞深入琼脂中，从而降低了等离子体对中心区域的处理效率。

图2.4.4　白色念珠菌的SEM 图像[74]

图2.4.4为对照组和经等离子体处理过的白色念珠菌的SEM 图像。图2.4.4（a）～（d）分别对应处理时间为0min、2min、4min和8min。通过对比可以发现，未经处理的白色念珠菌成圆球状，并且细胞外部结构是完整的，而经等离子体处理的细胞表面具有明显的缝隙或者破裂情况，这表明等离子体会对细胞壁或膜结构造成损害。随着处理时间的增加，这种结构性损伤更为明显，细胞也逐渐向碎片化发展。经过8min的处理，白色念珠菌的细胞结构被完全破坏。

图2.4.5为对照组以及等离子体处理组的TEM 成像。图2.4.5（a）为未经等离子体处理的典型白色念珠菌的TEM 图像。从图中我们可以看出细胞壁是均匀的，细胞膜是完整的，细胞质是均匀的。图2.4.5（b）～（d）是细胞经过等离子体处理后观察到的不同程度超微结构的破坏情况。从图2.4.5（b）可以清楚地看到细胞形态发生了改变，即细胞膜出现破裂，细胞质出现外流。在图2.4.5（c）中观察到了更为严重的细胞破坏情况，即细胞质从细胞中大量溢出，细胞内观察不到任何完整的细胞器结构。更为有趣的是，在该图中甚至可以看到脂质小体。图2.4.5（d）给出了表征细胞死亡的典型的核固缩现象。

图2.4.5　等离子体处理后的白色念珠菌的TEM 图像[74]

（a）为正常的白色念珠菌细胞；（b）～（d）为等离子体处理后白色念珠菌3 种典型的细胞内部结构图

图2.4.6　加盖条件下N-APPJ的光谱诊断结果[74]

图2.4.6为加盖条件下N-APPJ产生的典型发射光谱（300～800nm）。可以清楚地看到等离子体射流中存在激发态和He等粒子。值得指出的是，加盖时，O 原子（波长777nm）的相对强度要比无盖条件下高出约两个数量级。由于O 原子在生物医学应用中的重要作用，因此限制细胞样品与大气环境接触将能够有效提高处理效率。