大气压等离子体射流口腔混合菌种生物膜作用

通常情况下，口腔内疾病的诱发并不是由单一的菌种所形成的生物膜导致的，病原生物膜中常常含有各种不同种类的致病菌。例如细菌致龋齿的首要条件是定植在牙面形成牙菌斑，它是口腔内一种具有复杂细菌群结构的生物膜，其抗药性及各种生化代谢率均高于浮游细菌。因此，使用等离子体对口腔混合菌种进行灭活研究具有十分重要的临床意义。为此，本节下面将介绍N-APPJ针对口腔内混合菌种生物膜的作用深度的研究成果。

1.口腔混合菌种生物膜的培养

唾液收集：收集健康志愿者（饭后，刷完牙，停止饮水1.5h）的唾液于无菌塑料管内，加入2.5 mmol/L 苏糖醇，搅拌10 min后，在4 ℃下离心10 min（30000g）。取上清液，用PBS稀释成50%的溶液，用孔径0.22μm 的无菌滤膜过滤，于-20 ℃保存备用。为了验证其是否无菌，可以将其接种在厌氧血琼脂培养基上，在37 ℃厌氧和有氧条件下分别培养72h，观察菌落生长情况。

菌液制备：用分光光度法在BHI培养基内制备菌液，使其含有空腔链球菌（CECT90T）103 CFU/mL、内氏放线菌（ATCC19039）105 CFU/mL、小韦荣球菌（NCTC11810）105 CFU/mL、具核梭杆菌（DMSZ20482）106 CFU/mL、牙龈卟啉单胞菌（ATCC33277）106 CFU/mL 及伴放线菌聚集菌（DMSZ 8324）106 CFU/mL。

生物膜培养：将无菌牛牙本质块（5mm×5mm×0.17mm）放入24孔板内，加入上述50%无菌唾液，在37 ℃洁净环境下培养4h。吸出孔内唾液，每孔加入1.5mL混合菌液和2.5mL 的脑心浸液肉汤，于37 ℃厌氧条件下培养3周，隔天换液。

2.等离子体处理口腔混合菌种生物膜

实验装置结构与2.2.1节的相同。采用高压直流驱动，其工作电压幅值为15kV，工作气体为He+1%O2，气体流量为0.5L/min。实验分为三组，其中N 组为空白对照组，为了进一步与临床靠拢，特增加A 组，将生物膜样品分别用生理盐水处理2 min 和5 min，B 组则用等离子体分别处理2 min 和5min。每组实验重复三个样本。

3.实验结果分析

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图2.3.15　等离子体处理口腔混合菌种生物膜的三维CLSM 图像[62]

图2.3.16　各组灭活效果统计结果[62]

图2.3.15和图2.3.16分别为实验中各组口腔混合菌种生物膜的CLSM 3D 图像以及灭活效果统计图。由图可知，2min的生理盐水冲洗对于生物膜的影响不大，5min的冲洗使得生物膜的厚度有所下降，这可能是由于生理盐水的浸泡使得生物膜结构变得松软而使得生物膜表面的浮游细菌及连接不够紧密的上层细胞发生了脱落。因此，生理盐水的冲洗并不能真正地灭活细菌，而只能在物理上有所辅助。由于实际临床上的冲洗时间不超过30s，因此本实验所得到的生理盐水的处理效果在实际情况下还会进一步降低。

从图2.3.15（d）和（e）的三维CLSM 图像可以看出，N-APPJ处理对于混合菌种生物膜有很好的作用效果。由于等离子体对细胞膜表面的刻蚀作用，经过5min的等离子体处理，生物膜的厚度下降了约三分之一。由图2.3.16的柱状统计结果可知，对照组中的死亡细菌比率约为8%，而2min的生理盐水冲洗的死亡细菌比例和对照组差不多，说明短时间内生理盐水冲洗对混合菌种生物膜几乎没有作用。即使经过5min的生理盐水冲洗，生物膜中的死亡细菌比例也仅仅增加到18%，进一步证明了上述结论。由于生理盐水冲洗掉了上层中的活细胞，而底层的死亡细胞本来就较上层的多，所以使得整体死亡细菌比率增加。

而等离子体处理能够有效灭活生物膜内的细菌，由图2.3.16可知，经过2min 的N-APPJ处理，生物膜内细菌灭活率达到55%以上，而5minN-APPJ处理效果更是达到75%以上。由于混合生物膜的激光共聚焦扫描显微镜的扫描步长为1μm，共扫描了40 层，故此等离子体至少能穿透40μm 的混合菌种生物膜。

然而，必须注意的是，在同样的条件下，处理单一的粪肠球菌生物膜，等离子体处理5min的灭活效率超过90%，而处理混合菌种时只有75%左右，这是由本实验混合菌种中包含了各种不同的细菌（包括口腔链球菌、内氏放线菌、小韦荣球菌、具核梭杆菌、牙龈卟啉单胞菌及伴放线菌聚集菌等）造成的。由于这些细菌属性不同，细胞构造不同，生长环境不同，对营养的要求以及抗恶劣生存条件的差异的不同，使得最终等离子体对混合菌种生物膜的灭活率有所下降。