大气压非平衡等离子体射流改善粪肠球菌生物膜

与牙龈卟啉单胞菌类似，在实际情况下，粪肠球菌也是以生物膜的形式存在的。已有研究指出，粪肠球菌可在封装有Ca（OH）2的根管内形成生物膜结构，从而使其能够抵抗常规根管内封药，导致根管内慢性感染[66]。因此，进一步研究N-APPJ对粪肠球菌生物膜的作用深度非常重要。

粪肠球菌生物膜按标准方法培养获得。这里采用的等离子体装置如图2.3.11 所示。该手持式N-APPJ射流仅由12V 电池驱动，无需其他外部电源，也无需任何外部供气装置。该装置通过直流升压器将12V 电压转换为10kV 高压驱动气体放电。电极采用12根不锈钢针阵列结构，单个针尖的直径约为50μm。图2.3.11（a）所示的限流电阻R1和R2均为50MΩ，用于限制放电电流。这样做是为了最大程度减小等离子体对人体的电击感，使其能够安全地触摸，如图2.3.11（b）所示。经过测量，等离子体射流的气体温度在20 ℃～28 ℃范围内，保持室温的水平。

图2.3.11　等离子体射流处理生物膜的装置图[67]

图2.3.12（a）和图2.3.13（a）分别是对照组（未处理组）样品和等离子体处理组样品的三维CLSM 图像。图2.3.12（b）～（e）和图2.3.13（b）～（e）分别是对照组和等离子体处理组样品的二维CLSM 图像。图像中的红色斑点表示死细胞，而绿色斑点表示活细胞。用CLSM 对生物膜从最上层表面到最下层逐层进行扫描得到上述二维图像。每个样品包含17 层，预设步长为1.5 μm，因此生物膜总厚度约25.5μm。

图2.3.12　对照组样品CLSM 图像和特定层二维CLSM 图像[67]

（a）为对照组样品的三维CLSM 图像；（b）～（e）为第1层、第7层、第13层和第17层的二维CLSM 图像。从图中可以看出所有细胞均为活细胞

从图2.3.12（a）和图2.3.13（a）中可以看出，对照组样品呈绿色而处理组样品完全呈红色。因此同样可以得出结论，室温空气等离子体能够有效灭活生物膜表层以上的细菌。然而，由于生物膜具有多层结构，因此，研究N-APPJ能否有效地灭活生物膜表层以下的细菌同样重要。而通过对比对照组和实验组可以发现，经等离子体处理的样品的全部17层细胞几乎全部被杀死。这证实了等离子体产生的活性粒子能够穿透25.5μm 厚的粪肠球菌生物膜并发挥杀菌作用。(www.xing528.com)

为了进一步研究等离子体手电产生的活性粒子的种类，使用光谱仪测量了该空气N-APPJ的发射光谱。图2.3.14给出了测得的250～800nm 范围内的典型发射光谱。可以清晰地看到等离子体手电产生的活性粒子由激发态N2和O 原子主导。

图2.3.13　等离子体处理5min组样品的三维CLSM 图像和特定层二维CLSM 图像[67]

（a）为等离子体处理5min组样品的三维CLSM 图像；（b）～（e）为第1层、第7层、第13层和第17层的二维CLSM 图像

图2.3.14　等离子体手电发射光谱[67]

由2.2.2节可知，激发态的N2粒子对细菌的灭活作用并没有ROS重要。因此，ROS在细菌灭活中更为关键。Yan等也提出ROS会导致细胞内部发生各种生物化学反应[68]。这些活性ROS可以通过与生物膜发生反应，从而起到杀菌效果。通过进一步测量该等离子体手电的紫外线强度，发现其能量通量小于0.05 W/cm2[69，70]，因此，该装置紫外线辐射在灭活生物膜中的细菌中所起的作用其实是很小的。这也是该等离子体手电装置的一个显著优点。