大气压等离子体射流粪肠球菌灭活-生物医学应用

除了牙龈卟啉单胞菌之外，粪肠球菌也是人体上呼吸道、口腔、消化道和肠道的常见细菌之一。粪肠球菌是革兰阳性菌，兼性厌氧，单菌体呈圆形或椭圆形，可以引起心内膜炎、胆囊炎、脑膜炎、尿路感染及伤口感染等多种疾病。同时，由于其可长期存活于营养极其匮乏的环境中，耐酸碱能力强，因而是导致牙齿根管治疗失败的主要感染菌之一。为此，本节以粪肠球菌为研究对象，介绍粪肠球菌的浮游菌在N-APPJ作用下的灭活情况。

首先使用比浊仪将粪肠球菌浓度调制成0.5 麦氏浓度（1.5×108CFU/mL）备用。开展杀菌实验时再将此菌悬浮液稀释100倍，使用接种棒将菌液均匀涂布于无菌的琼脂培养基中，之后进行等离子体处理。

采用的N-APPJ装置与2.2.1节相同。图2.3.7（a）给出了脉冲直流驱动的N-APPJ处理粪肠球菌示意图，其工作电压幅值为8kV，频率为10kHz，脉宽为1600ns。采用的工作气体为He+2%O2，气体流量为2L/min。实验首先研究不同作用时间下N-APPJ对粪肠球菌的灭活效果。实验时将25 个培养皿随机分为5组，实验组作用时间分别为5min、10min、15min，每组5例样本，阳性对照组和阴性对照组各5 例。将涂好的粪肠球菌实验组分别用等离子体射流处理5min、10min、15min；对照组仅用气流（无等离子体）处理，时间为15min；另一对照组不做任何处理。将处理后的培养皿置于37 ℃恒温培养箱中培养24h。培养24h 后用游标卡尺分别测量培养皿中抑菌圈直径，并做记录。每个实验条件重复三个样本。

实验还进一步研究了不同作用环境下N-APPJ对粪肠球菌的灭活影响。具体地，实验分为两组，一组为不加盖处理组，其菌样直接暴露在大气环境中，如图2.3.7（c）所示；另一组为加盖处理组，如图2.3.7（d）所示，仅在盖子中心位置开一个射流直径相同的小孔（大约5mm），以保证射流能够接触细菌。处理时间为10min，将处理后的培养皿置于37℃恒温培养箱中培养24h。培养24h 后用游标卡尺分别测量培养皿中抑菌圈直径，并做记录。每个实验条件重复三个样本。

图2.3.7　等离子体射流处理粪肠球菌的装置和放电特性[64]

由2.2.2节可知，该N-APPJ对金黄色葡萄球菌灭活效果非常明显。由于粪肠球菌和金黄色葡萄球菌同属革兰氏阳性球菌，因此本实验通过采用相同的等离子体参数来研究N-APPJ对粪肠球菌的灭菌效果。结果如图2.3.8（a）和（d）所示，经过2min的N-APPJ处理，金黄色葡萄球菌平均抑菌圈直径为（2.62±0.26）cm，粪肠球菌抑菌圈直径为（1.06±0.30）cm，经统计学分析两组间有显著差异（P＜0.05）。

图2.3.8　等离子体处理粪肠球菌和金黄色葡萄球菌的总体结果[64]

（a）粪肠球菌和金黄色葡萄球菌的抑菌圈对比；（b）不同时间下N-APPJ的处理结果对比；（c）加盖和不加盖条件下等离子体处理结果；（d）抑菌圈直径统计分析：t检验，*P＜0.05 表示与另一组有显著性差异；（e）不同时间下N-APPJ处理粪肠球菌的抑菌圈直径统计分析：单因素方差分析， **P＜0.01 表示与其他组比较均有极显著性差异

图2.3.8（c）进一步比较了加盖以及不加盖条件下的N-APPJ处理结果。可以得出，在相同的处理时间下，在培养皿上加盖的处理组效果要远远强于不加盖的等离子体处理组。特别地，在加盖条件下，等离子灭活范围分布更为均匀，这主要是由于培养皿盖对气流和活性粒子的限制作用，使得放电时培养皿内活性粒子浓度不断增加，并使其能够更为均匀地分布在培养基表面，因而有效地扩大了等离子体的灭活范围。(www.xing528.com)

图2.3.8（e）进一步统计了不同处理时间下的N-APPJ的灭活效率。可以看出，当用N-APPJ处理粪肠球菌培养皿5min、10min、15min 后，游标卡尺测量抑菌圈直径的平均值分别为（1.48±0.24）cm、（3.64±0.27）cm 和（8.16±0.51）cm，而对照组无抑菌圈形成。单因素方差分析揭示各组间有显著性差异（P＜0.01），当处理时间延长5min，相应的灭菌效果则成倍提升。

图2.3.9为等离子体处理前后的粪肠球菌的SEM 图像。其中，图2.3.9（a）为正常的粪肠球菌菌体的表面结构形态，图2.3.9（b）则为等离子体处理5min 后的粪肠球菌细胞结构形态。由图中可以看出，正常的粪肠球菌菌体呈椭圆形，表皮光滑，细胞膜结构完整；而经过5min的N-APPJ处理后，粪肠球菌细胞出现萎缩、破裂及碎片化，这说明等离子体的处理能够破坏粪肠球菌的细胞膜结构，导致胞内物质流失，进而导致了细胞死亡。

图2.3.9　粪肠球菌的SEM 图像[62]

图2.3.10为等离子体处理前后的粪肠球菌内部结构变化的TEM 图像。其中，图2.3.10（a）为对照组中的正常粪肠球菌透射照片，图2.3.10（b）～（d）为等离子体处理后的3种典型性粪肠球菌细胞内部结构。由图可知，未经等离子体处理的细胞呈椭圆形，细胞膜完整，胞内物质密度均匀；图2.3.10（b）中的粪肠球菌细胞膜开始消融，细胞膜功能失活，胞内物质开始流失，细胞出现皱缩；图2.3.10（c）则显示了细胞膜破裂后胞内物质外流的情景；图2.3.10（d）中给出了等离子体处理后粪肠球菌细胞膜破裂，胞内物质完全流失的结果。

图2.3.10　粪肠球菌的TEM 图像[65]

（a）为正常的粪肠球菌；（b）～（d）为等离子体处理后的几种典型的粪肠球菌细胞损伤情况

由2.2.2节可知，等离子体中含有大量的带电粒子以及ROS（如OH、O）等物质。因此，带电粒子可能会在电场的作用下快速撞击细胞表层，使分子间化学键发生断裂，同时依靠大量ROS成分与细胞表面的蛋白质或者脂肪等作用，使蛋白质发生变性或者形成脂质过氧化物，从而使得细胞膜功能丧失而出现细胞破碎、细胞质外流等现象，这样大量的活性粒子就能进入细胞膜直接作用于胞内物质和遗传物质，从而导致细胞死亡。