尽管研究证实了N-APPJ对浮游形式的牙龈卟啉单胞菌的灭活作用，然而在实际情况下，牙龈卟啉单胞菌通常是以生物膜的形式存在的，由于生物膜的保护作用，牙龈卟啉单胞菌不易被抗菌剂杀灭，这也是导致慢性牙周炎等疾病的主要原因。对于生物膜相关的细菌感染疾病的常用治疗手段是用抗生素，但是细菌生物膜对于抗菌药物和宿主的防御体系具有天然的抵抗力，再加上耐药因子的传播，特别是随着抗生素的广泛应用、耐药菌株异常增加，使得传统抗生素的疗效有限。为此，基于以上因素，下面就N-APPJ对于牙龈卟啉单胞菌生物膜的作用深度展开进一步研究。
首先按标准流程培养牙龈卟啉单胞菌生物膜。所采用的等离子体装置与2.3.1节相同，采用脉冲高压驱动，其工作电压幅值为8kV，频率为10kHz，脉宽为1600ns。采用的工作气体为He+1%O2混合气体，气体流量为1L/min。喷嘴末端距样本的间距为1cm。实验分对照组和等离子体处理组，其中，对照组仅利用气流（无等离子体）处理5min，处理组则利用等离子体处理5min，每组实验重复三个样本。图2.3.3给出了N-APPJ处理牙龈卟啉单胞菌生物膜的照片。
图2.3.3 等离子体射流作用于牙龈卟啉单胞菌生物膜的装置图和实物照片[63]
共聚焦激光扫描显微镜（confocal laser scanning microscope，CLSM）是以激光作为激发光源，采用光源针孔与检测针孔共轭聚焦技术，对样本进行断层扫描，以获得高分辨率光学切片的荧光显微镜系统。
扫描电子显微镜（scanning electron microscope，SEM）简称为扫描电镜，它是利用细聚焦的电子束轰击样品表面，通过电子与样品间的相互作用产生的二次电子、背散射电子对样品表面或断口形貌进行观察和分析。
N-APPJ处理前后牙龈卟啉单胞菌生物膜的三维CLSM 照片如图2.3.4所示。其中图2.3.4（a）、（b）分别为对照组和5min等离子体处理组的结果。图中绿色代表活细胞，红色代表死细胞。从图中可以看到，对照组样本完全呈绿色，而N-APPJ处理组则几乎全是呈红色的死细胞。这说明5 min的等离子体处理对牙龈卟啉单胞菌生物膜有着十分好的灭活作用。
生物膜具有多层结构。而图2.3.4（b）只表明N-APPJ能有效杀死生物膜表层的细菌，那么对于更深层的细菌，N-APPJ灭活效率究竟如何？ 为了获得N-APPJ对生物膜更深层处的细菌的杀菌效果，进一步采用逐层扫描分析，其中CLSM 的扫描步长为1μm。由于该细胞生物膜厚度约为15μm，因此共扫描了15层。不同层的二维CLSM 照片如图2.3.5所示。由于单个牙龈卟啉单胞菌的尺寸约为0.3μm×0.8μm×0.3μm，因此牙龈卟啉单胞菌的生物膜实际约有30层，即每层图像包含大约2层牙龈卟啉单胞菌细胞。
图2.3.4 牙龈卟啉单胞菌生物膜的三维CLSM 照片[63](www.xing528.com)
绿色表示活细胞，红色表示死细胞
图2.3.5 不同层的牙龈卟啉单胞菌生物膜的二维CLSM 图像[63]
（a）～（d）为对照组；（e）～（h）为N-APPJ处理组。绿色表示活细胞，红色表示死细胞
由图2.3.5可以看出，生物膜的细胞密度从第11 层开始逐渐减小，这是由于底层细菌生存环境恶劣、营养匮乏的缘故。对于对照组，扫描结果显示从第1层到第10层几乎无死亡细胞，而极少数死细胞（红色）出现在第11层以后。由于气体首先是与顶层生物膜接触，但从第1层到第10层几乎无死亡细胞，因此可以得出结论，即从第11层开始所观察到的死亡细胞很可能是由于缺乏营养导致的自然死亡，而气流自身对牙龈卟啉单胞菌生物膜没有影响。
N-APPJ处理组的扫描结果如图2.3.5所示。可以看出，细胞数量同样从第11层开始减少，这与对照组的扫描结果是一致的。然而，染色结果表明，经过5min的N-APPJ处理，牙龈卟啉单胞菌生物膜（1～15层）内的所有细菌几乎全部死亡。因此可以得出结论：等离子体可以穿透至少15μm 的牙龈卟啉单胞菌生物膜，并杀死其中的细菌。
为了更加直观地了解生物膜的结构形态，进一步使用扫描电镜技术对牙龈卟啉单胞菌生物膜进行了观察。图2.3.6 为对照组和N-APPJ处理组的SEM 图像（1000倍放大）。可以看出，对照组的牙龈卟啉单胞菌活细胞呈球杆状，并相互连接在一起形成致密的生物膜结构。而经N-APPJ处理的牙龈卟啉单胞菌生物膜如图2.3.6（b）所示，其层状结构明显消失，单体细胞呈萎缩状或碎片化，并且上层细胞由于等离子体的刻蚀作用而破裂消失，这与CLSM 扫描结果相符。
图2.3.6 牙龈卟啉单胞菌生物膜的SEM 图像[62]
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