大气压非平衡等离子体射流灭活卟啉单胞菌

牙龈卟啉单胞菌是一种革兰氏阴性产黑色素的厌氧菌。大量研究发现，牙龈卟啉单胞菌在成人牙周炎中检出率最高，并被认为是成人牙周炎的主要致病菌之一[60，61]，能够导致慢性牙周炎、侵袭性牙周炎、牙周脓肿等疾病。为此，本节将介绍N-APPJ对牙龈卟啉单胞菌的灭活效果的研究成果。

实验时采用比浊仪将牙龈卟啉单胞菌菌液浓度调制成0.5 麦氏浓度（1.5×108 CFU/mL）备用。开展杀菌实验时再将此菌悬浮液稀释100倍，使用接种棒将菌液均匀涂布于无菌的厌氧血琼脂培养基中，之后进行等离子体处理。

采用与2.2.1节相同的N-APPJ装置。采用脉冲高压驱动，工作电压幅值为8kV，频率为10kHz，脉宽为1600ns。采用的工作气体为He及He+3%O2混合气体，气体流量为1L/min。实验具体分为五组，其中，（a）组作为对照组；（b）组和（c）组为纯He等离子体处理组，处理时间分别为8 min 和12min；（d）组和（e）组为He+3%O2等离子体处理组，处理时间同样分别为8min 和12min。处理完毕后将样品放入厌氧袋内，然后置于37 ℃恒温箱中培养5天后取出拍照，观察灭活效果。每组实验重复三个样本。

这里还采用透射电子显微镜（TEM）对处理前后的细菌进行观察，了解其形态的变化。TEM 是应用最为广泛的一种电子显微镜，它主要是利用透射电子成像，因而要求样品较薄（100kV 时，样品厚度不超过100nm）。TEM 的分辨率可达0.1nm。这里采用TecnaiG212分析型TEM（FEI公司）观察菌样内部结构。

图2.3.1给出了牙龈卟啉单胞菌的实验结果。由图可知，对于不经任何处理的空白对照组（a），牙龈卟啉单胞菌长满于培养皿，而经等离子体处理的四组样本均出现了明显的抑菌圈，说明N-APPJ对于牙龈卟啉单胞菌有较好的灭菌效果。对比图2.3.1（b）、（c）可知，8min的纯He等离子体处理对于牙龈卟啉单胞菌抑菌圈较小，界限不是很清晰，而当处理时间增大到12min时才形成具有明显界限的抑菌圈，说明牙龈卟啉单胞菌比金黄色葡萄球菌的抗等离子体能力要强。而在相同的处理时间下，使用He+3%O2作为等离子体工作气体时，抑菌圈明显要大于纯He处理组。这是由于O2存在，等离子体中ROS显著增加，并向外扩散，从而使得处理面积增大。

图2.3.1　牙龈卟啉单胞菌培养结果[62](www.xing528.com)

（a）对照组；（b）He N-APPJ处理8min；（c）He N-APPJ处理12min；（d）He+3%O2N-APPJ处理8min；（e）He+3%O2N-APPJ处理12min

图2.3.2给出了等离子体处理后的牙龈卟啉单胞菌细胞的TEM 图像，其中图2.3.2（a）为完整的牙龈卟啉单胞菌细胞，可以发现细胞成杆状，并且壁膜完好无缺。图2.3.2（b）和（c）为两种典型的等离子体处理后的细胞状态，图2.3.2（b）中细胞已经失去了杆状结构，细胞壁/膜被彻底破坏，细胞质流失，整个细胞呈碎片化分布；而图2.3.2（c）中的细胞则由于细胞膜受损而开始消融，细胞质开始向外流失，最终在等离子体作用下形成类似图2.3.2（b）的结果。因此，TEM 结果表明等离子体对细胞进行灭活时，首先是对细胞膜进行破坏，然后伴随着细胞质的流失，最终使细胞死亡。

图2.3.2　牙龈卟啉单胞菌的TEM 图像[63]

（a）正常的牙龈卟啉单胞菌细胞；（b）和（c）为两种典型等离子体处理后的PG 细胞的内部结构