核桃多肽生物活性探究

近年来，随着自由基生命科学研究的不断深入发展，抗氧化保护作用理论越来越受到重视和关注。癌症、衰老以及心血管等疾病被公认为与自由基代谢有密切关系。因而筛选一些具有抗氧化活性的天然资源是十分有必要的。已经发现一些肽类物质具有很多功能特性，例如抗氧化活性、免疫调节活性、抑制ACE活性、抗菌抗病毒活性、促微量元素吸收活性等。消化生理试验也证明，氨基酸不易被人体小肠吸收利用，而小分子肽（寡肽，不足10个氨基酸构成者称之）则易被吸收。

一、核桃多肽总还原能力的测定

（一）核桃多肽总还原能力的测定

将2mL一定浓度的样品与2mL，0.2mol/L磷酸缓冲液（PBS，0.2mol/L，pH 6.6）和2mL 1%铁氰化钾溶液混合均匀后在50℃水浴中反应20min后流水速冷，再加入2mL10%的TCA（三氯乙酸）溶液，在3000r/min离心10min。吸取2mL上清液于试管中，并加入2mL去离子水和0.4mL 0.1% FeCl₃，混合均匀，10min后在700nm处测光值，以去离子水作为空白，吸光值越大表明还原能力越强。

（二）核桃多肽清除羟基自由基测定

OH自由基的测定采用邻二氮菲-Fe²⁺氧化法。取0.75mmol/L的邻二氮菲溶液1mL于试管中，依次加入磷酸盐缓冲液（pH 7.4，0.2mol/L）2mL和蒸馏水1mL、0.75mmol/L硫酸亚铁液1mL，充分混合后，向混合液中加入1mL体积分数0.01%的H₂O₂溶液，于37℃下恒温反应60min，于536nm测其吸光值记为A_P；用1mL多肽溶液代替H₂O测得的吸光度记为A_S；用1mL蒸馏水代替H₂O₂测得的吸光度记为A_O；·OH自由基清除能力的计算公式如下：

（三）核桃多肽清除DPPH自由基测定

DPPH即1，1—二苯基-2—三硝基苯肼，是一种稳定的自由基，因DPPH自由基有单电子，其醇溶液呈紫色并在517nm处有强吸收峰，当自由基清除剂存在时，由于与其单电子配对而使紫色减弱，其褪色程度与抗氧化剂的强度成反比，因而可用分光光度法进行快速的定量分析，DPPH法广泛用于测定生物试样和食品的抗氧化能力。核桃蛋白肽清除DPPH自由基能力参照He等的方法。0.1mmol/L DPPH溶液用95%的乙醇溶液配制，向一定浓度的2mL样品液（多肽溶液、维生素C和GSH）中加入2mL的0.1mmol/L的DPPH溶液，混合均匀后室温条件下在暗室中反应30min，然后测定试样在517nm处的吸光值。清除率计算公式如下：

（四）核桃多肽清除超氧阴离子自由基测定

超氧阴离子自由基（·）的测定采用邻苯三酚自氧化法。准确吸取样品溶液（多肽、维生素C和GSH）1mL，加入浓度为0.05mmol/L，pH 8.2的Tris-HCl缓冲液4mL于25℃水浴10min，之后加入1mL浓度为6mmol/L的邻苯三酚溶液计时5min，每30s测定一次以确定最适反应时间，以100μL HCl终止反应，在420nm下测定吸光度，记为A_S；对照组以蒸馏水替代样品液吸光值记为A_O，以等体积的pH 8.2的Tris-HCl缓冲液为空白吸光值记为A_C，同一实验重复3次。超氧阴离子自由基清除能力的计算公式如下：

二、核桃多肽生物活性分析

（一）核桃多肽总还原能力

不同样品（核桃蛋白肽、维生素C和GSH）在不同浓度下的FRAP 活性测定结果见图10-10。

图10-10 不同样品的FRAP活性

由图10-10可知：在一定范围内，样品的FRAP 活性随着浓度的上升而加强，在0～1.6mg/mL范围内多肽和GSH的FRAP 活性随浓度的增加几乎呈直线形式上升，但是1.6～2.0mg/mL范围内，其FRAP活性增加随浓度的增加趋势减弱，维生素C也有类似的结果。在同等浓度下多肽的活性明显高于GSH，如在浓度为1.0mg/mL时，多肽的活性为GSH的2倍，但是与维生素C相比其抗氧化活性还有一定的差距，如在浓度为0.1mg/mL时，维生素C的FRAP 活性约为多肽的12倍。

（二）羟基自由基清除能力

由图10-11可知，核桃蛋白肽的羟基自由基清除活性高于同等浓度下的GSH，低于维生素C，多肽和GSH的羟基自由基清除率在0～3.0mg/mL范围内呈现直线上升的趋势，在浓度为3.0～4.0mg/mL范围内上升趋势减弱，在浓度为4.0mg/mL时，其羟基自由基清除率分别达到93.8%和87%。维生素C的羟基自由基清除活性在浓度为1.2mg/mL时几乎接近100%。三者的拟合方程分别为：

Y_多肽=24.644X+4.6528，R²=0.9815

Y_维生素C=-50.687X²+144.63X-2.8747，R²=0.994(www.xing528.com)

Y_GSH=2.245X+0.7016，R²=0.9873

图10-11 不同样品的羟基自由基的清除活性

计算三者对羟基自由基清除活性的IC₅₀，分别为多肽1.75mg/mL，维生素C 0.45mg/mL，GSH 2.07mg/mL。通过比较，可以明显得出三者对DPPH自由基的清除活性效果：维生素C＞多肽＞GSH。多肽的羟基自由基清除活性约为1.18倍，但是仅为维生素C的25%。通过比较发现，多肽的羟基自由基清除活性明显优于同等浓度的GSH，而GSH已经作为一种高效的抗氧化剂在食品、药品领域得以广泛应用，因此，核桃多肽作为一种新开发的天然抗氧化剂，在食品、药品领域也可能具有很好的应用价值。

（三）DPPH自由基的清除

由图10-12可知，核桃蛋白多肽具有较好的DP P H自由基清除能力，在浓度为0～0.6mg/mL范围内，随着浓度的提高其清除活性呈现逐渐增强的趋势；在0.6～1.6mg/mL范围内，随浓度的提高其抗氧化活性变化不明显。GSH和维生素C的DPPH自由基清除活性变化规律与之相似。在同等浓度下，多肽的DPPH自由基清除活性高于GSH，但低于维生素C，浓度为0.6mg/mL的多肽的DPPH自由基清除率与60μg/mL的维生素C相似，即维生素C的抗氧化活性大约为多肽的10倍左右。多肽在浓度为1.0mg/mL时对自由基的清除率达到87.9%，略高于同等浓度的GSH。对3种样品的DP P H自由基清除活性进行曲线拟合，得到如下方程：

Y_多肽=266.3X³-534.74X²+353.73X+5.1449，R²=0.98

Y_维生素C=0.0001X³-0.0345X²+2.9219X+1.2776，R²=0.9983

Y_GSH=-123.69X²+202.95X+2.2473，R²=0.9957

图10-12 不同样品的DPPH自由基的清除活性

计算多肽对DPPH自由基清除活性的半抑制浓度IC₅₀为145μg/mL，显著低于GSH的IC₅₀710μg/mL，同时略低于He等制备的菜籽肽IC₅₀159μg/mL。

核桃蛋白多肽作为一种天然的抗氧化剂，其抗氧化活性高，是一种潜在的用于食品或药品的天然抗氧化剂。

（四）超氧阴离子自由基清除能力

超氧阴离子自由基在人体内广泛存在，本身不发生化学变化，对人体无害，但是与羟基结合后的产物会导致细胞DNA损坏，破坏人类机体功能，在体内主要靠超氧化物歧化酶清除。由图10-13可知，不同样品的超氧阴离子自由基清除活性随浓度的不断上升呈现增加趋势，对3种物质的清除曲线拟合结果如下：

Y_多肽=19.932X+4.7293，R²=0.9767

Y_维生素C=113.85X-1.5218，R²=0.9935

Y_GSH=20.02X-3.0122，R²=0.9831

图10-13 不同样品的超氧阴离子自由基清除活性

经计算，对超氧阴离子自由基清除活性的IC₅₀分别为多肽2.2mg/mL，维生素C 0.45mg/mL，GSH 2.5mg/mL。多肽的超氧阴离子自由基清除率介于维生素C和GSH之间。王群等通过酶解法制备鲽鱼鱼皮胶原蛋白肽，对超氧阴离子自由基的IC₅₀为7.98mg/mL；孔令明采用碱性蛋白酶酶解核桃蛋白制备的多肽，在最佳的工艺条件下对超氧阴离子自由基的清除率为47.85%；张敏等研究米糠蛋白水解液发现，M_w＞10ku的米糠多肽对超氧阴离子自由基的清除率为50.42%；M_w为3～10ku的多肽，清除率为51.43%；M_w＜3ku的多肽，清除率为63.03%。通过与相关多肽的超氧阴离子自由基清除活性对比发现，核桃多肽的超氧阴离子自由基清除率的IC₅₀较小，即其抗氧化活性相对较高，具有较高的应用价值。