结构决定功能，多肽的功能特性取决于多肽的分子质量分布以及氨基酸的组成，测定多肽分子质量方法很多，如HPLC、HPCE、质谱、凝胶电泳等。HPLC法与其他方法相比较，主要的特点是肽的回收率很高，同时分辨率高于离子交换色谱和疏水作用色谱。本试验主要采用了高效液相色谱法（HP LC）来测定核桃多肽的分子质量分布及其氨基酸组成。
一、平均肽链长度（PCL）与平均相对分子质量（Mw）的测定
若一个蛋白质分子未被水解时肽链长度（即肽中的氨基酸的平均数目）为PCL0，则肽键总数目为PCL0-1，当被切开n-1个肽键而水解成n个肽时，在DH较高的情况下，水解度与多肽段平均大小的关系大约表示如下。
1.核桃多肽分子质量分布测定的条件
采用Tskgel 2000SWXL 300mm×7.8mm的色谱柱对野生肽分子质量进行分析，流动相为乙腈/水/三氟乙酸（45/60/0.1体积比），检测波长为220nm，流速为0.5mL/min，柱温为30℃。
以细胞色素C（MW12384）、杆菌酶（MW1422）、乙氨酸—乙氨酸—酪氨酸—精氨酸（MW451）和乙氨酸—乙氨酸—乙氨酸（MW189）为相对分子质量标准品。
2.样品的制备
取样品100mg左右于10mL容量瓶中，用流动相稀释至刻度，超声5min，离心后微孔过滤膜过滤后供进样。
3.核桃多肽截留组分分子质量分布的测定
酶解产物用超滤膜超滤后（中空纤维超滤膜，切割分子质量MW=3000u）截留组分采用HP LC测其分子质量分布，测定条件及样品制备同上。(www.xing528.com)
二、核桃多肽相对分子质量分布
超滤后核桃多肽相对分子质量测定的高效液相色谱图如图10-7所示。
图10-7 超滤后核桃多肽相对分子质量测定的高效液相色谱图
标品的HP LC图谱如图10-8所示，其相对分子质量的标准曲线如下图10-9所示。
图10-8 标品的HPLC图谱
图10-9 相对分子质量标准曲线
由图10-8和图10-9可得，相对分子质量的标准曲线为：Log=6.63-0.225T，R=0.9977。表示了各相对分子质量对数和标品的洗脱时间线性相关性很高，可以准确地测定出核桃多肽的具体相对分子质量分布情况，超滤后核桃多肽相对分子质量分布见表10-2。
核桃蛋白水解后得到不同相对分子质量的肽段，由表10-3中可以看出核桃多肽分子质量分布主要集中在180～500u，占36.39%，其次是分子质量为500～1000u和180u以下的多肽，大部分肽的分子质量分布在2000u以下，约占88%。
表10-2 超滤后核桃多肽相对分子质量分布
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