多肽制备工艺-核桃油加工技术

一、核桃多肽制备的工艺流程

二、酶制剂的筛选

选取碱性蛋白酶、中性蛋白酶、酸性蛋白酶、风味蛋白酶及木瓜蛋白酶五种蛋白酶，在其各自酶的标准条件下称取同等质量的核桃分离蛋白进行水解，以水解度为指标比较选出水解效果最好的两种蛋白酶。

三、核桃多肽制备的单因素试验

（一）pH的确定

对于中性蛋白酶选择水解pH为6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，碱性蛋白酶选择水解pH为8.0、8.5、9.0、9.5、10.0五个因素下分别进行试验，其他条件为酶解温度45℃，水解时间3h，加酶量为6000u/g，测定不同pH条件下核桃分离蛋白的水解程度。

（二）加酶量的确定

分别选择加酶量为2000，4000，6000，8000，10000u/g五个因素来进行试验，水解时间3h，中性蛋白酶和碱性蛋白酶酶解温度分别为45℃和50℃，碱性蛋白酶pH为9.0、中性蛋白酶pH为7.0的条件下测定不同加酶量下核桃分离蛋白的水解程度。

（三）温度的确定

分别选取35，40，45，50，55℃五个因素来进行试验，水解时间3h，加酶量为6000u/g，碱性蛋白酶pH为9.0、中性蛋白酶pH为7.0的条件下测定不同温度下核桃分离蛋白的水解程度。

（四）水解时间和水解度的确定

在碱性蛋白酶为50℃、中性蛋白酶为45℃下酶解，加酶量为6000u/g，碱性蛋白酶pH为9.0、中性蛋白酶pH为7.0的条件下分别水解1，2，3，4，5h，测定不同时间下核桃分离蛋白的水解程度。

（五）水解度的测定

水解度的定义指的是，蛋白质在水解过程中，被断裂的肽键数和蛋白质中总肽键数的百分比。通常采用pH-stat法，在水解过程中不断添加碱液，前一个小时每10min记录一次0.5mol/L NaOH溶液用量，后每30min记录一次，水解完毕，对其进行灭酶处理，根据所添加的NaOH量，计算水解度。水解度计算公式如下：

式中 B——水解过程中NaOH消耗量，mL

N_b——水解所用NaOH浓度，mol/L

M_p——被水解的蛋白质量，g

h_tot——单位质量原料蛋白中肽键的总数，mmol/g

α——蛋白氨基的平均解离度，可用式10-2计算而得：

式中 pH——酶解过程中反应液的pH

pK——α-NH³⁺的解离常数（通常取数值7）

四、核桃蛋白水解条件优化

根据单因素的结果可以看出，碱性蛋白酶的效果优于中性蛋白酶，所以选取中性蛋白酶各因素的最优水平，先进行水解，选取碱性蛋白酶的酶解温度、酶解pH和酶解时间三个因素考虑其交互作用进行Central-Composite Design法响应面试验设计。

五、酶解核桃蛋白工艺条件的确定

（一）酶活力测定的标准曲线

酶活力定义：1g固体或液体蛋白酶，在一定温度和pH条件下，lmin水解蛋白产生1μg酪氨酸为一个酶活力单位，以U/g表示。ILApu单位为每分钟水解lmmol L—亮氨酸—对硝基苯胺所需的酶量如图10-1所示。

图10-1 酪氨酸溶液标准曲线

（二）蛋白酶酶活力测定

酶活力测定结果见表10-1。(www.xing528.com)

表10-1 酶活力测定结果

（三）蛋白酶的确定

以核桃蛋白为反应底物，以水解度为指标，试验选取的五种蛋白酶的酶解效果如图10-2所示。

图10-2 蛋白酶的水解效果比较

由于不同的蛋白酶的水解能力不同，筛选出较为优良的两种蛋白酶作为水解核桃分离用的酶制剂，水解更彻底，水解效果更佳。

由图10-2可知，这五种蛋白酶的水解效果由高到低的排列依次为：碱性蛋白酶＞中性蛋白酶＞酸性蛋白酶＞木瓜蛋白酶＞风味蛋白酶。所以选取碱性蛋白酶和中性蛋白酶作为制备核桃多肽的两种酶。

（四）不同条件对蛋白酶酶解反应的影响

1.pH对核桃蛋白水解度的影响

pH对两种蛋白酶水解效果的影响如图10-3所示，不同酶的最适pH是不同的，各个酶只有在各自最适的pH 下，才会使酶解效果最好。由图10-3可知，碱性蛋白酶最适的pH为9.0，中性蛋白酶最适的pH为7.0；pH高于或低于这个值，水解效果都达不到最佳。因为酶促反应速率主要受到pH通过去影响酶活力进而被影响，过酸或过碱的环境都容易使酶的空间结构被破坏，程度严重直接导致酶变性失活，而且pH对底物和酶分子的解离状态有影响，从而影响两者复合物的形成，降低酶解效果。因此，在各个酶的最适pH下进行水解，效果最好。另外从图中还可以看出来碱性蛋白酶的水解效果优于中性蛋白酶。

2.加酶量对核桃蛋白水解度的影响

加酶量对两种蛋白酶水解效果的影响如图10-4所示，由图10-4可知，对于两种蛋白酶来说有着相同的变化趋势，随着加酶量的增大，水解度呈现不断上升的趋势，当加酶量超过6000u/g时水解度趋于平缓，可能是由于当加酶量达到一定程度时，蛋白酶与底物的接触已经达到饱和状态，因此继续添加酶量对水解度的影响较小，考虑到节约生产成本，宜选用6000u/g的加酶量为最佳条件。

图10-3 pH对两种蛋白酶水解效果的影响

图10-4 加酶量对两种蛋白酶水解效果的影响

3.温度对核桃分离蛋白水解度的影响

温度对两种蛋白酶水解效果的影响如图10-5所示，由图10-5可知，两种酶有不同的最适温度，分别为：碱性蛋白酶50℃，中性蛋白酶45℃。温度对酶活性影响较大，只有在最适温度，才能达到最佳的酶解效果。在达到最佳温度前的升温，酶解反应会随温度升高而加速，当到达最适合的温度时，水解效果最好，水解度达到最大。此后，如果继续升高温度会使酶变性而失活，水解速度下降，水解效果变差。所以要达到最佳的水解效果，要使不同的蛋白酶都达到最佳水解温度。

图10-5 温度对两种蛋白酶水解效果的影响

4.水解时间对核桃分离蛋白水解度的影响

时间对两种蛋白酶水解效果的影响如图10-6所示，由图10-6可知，两种蛋白酶的水解效果都是随着水解时间的延长，水解度呈现逐渐增大的趋势，在水解的前3h水解度变化较大，在3h之后曲线趋于平缓，表明随着水解时间的延长，酶活逐渐减弱。在酶解反应初期，此时酶活力较强并且底物浓度较大，酶的作用位点最多，这时反应速率高，水解度的提升比较快；随着时间的增加，产物浓度增加，底物浓度降低，酶分子的催化反应有反馈抑制作用，酶促反应达到某种动态平衡，使酶解反应趋于平缓。考虑到经济效益的关系，两种蛋白酶都应选用3h作为最佳水解时间。

图10-6 时间对两种蛋白酶水解效果的影响

六、两种蛋白酶酶解核桃蛋白工艺条件的优化

在单因素试验的基础上，以酶解温度（A）、酶解pH（B）和酶解时间（C）作为试验3个因子，以水解度（Y）为指标，根据Box-behnken中心组合试验设计和响应面方法（RSM）优化核桃蛋白酶解条件。

（一）二次回归模型的拟合及方差分析

该模型的p＜0.0001，说明优化试验所选用的多元二次多项回归模型具有非常好的显著性，且失拟项p=0.1393＞0.05，证明失拟处理不显著。水解度的影响大小顺序为酶解时间＞酶解温度＞C酶解pH。

（二）响应面分析

应用响应面寻优分析方法对回归模型进行分析，寻找最优响应面结果为pH 9.07，酶解温度51.06℃，酶解时间3.7h，理论响应面水解度最优值为32.15%。考虑到实际操作，再综合双酶分步水解法的所有因素得到一个最优方案：在固定的底物浓度为5%条件下，先以中性蛋白酶酶解pH 7.0、酶解温度45℃、酶解3h、加酶量为6000u/g水解完成并灭酶后，再以碱性蛋白酶酶解pH 9.1、酶解温度51℃、加酶量为6000u/g酶解3.7h，验证试验重复三次后，取平均值得到实际水解度为34.03%。结果证明双酶分步水解法核桃蛋白的工艺条件优化具有可行性，最终达到的水解效果较好。

七、结论

最终得到最佳的双酶分步水解法制备核桃多肽的最佳工艺条件是：中性蛋白酶在pH为7.0，温度为45℃，加酶量为6000u/g的条件下先水解3h，灭酶后，再以碱性蛋白酶pH 9.1，酶解温度51℃，加酶量为6000u/g，酶解时间3.7h。验证试验得到核桃多肽的水解度最高为34%左右。