核桃蛋白是一种优质的植物蛋白，主要由四种蛋白质组成，分别是谷蛋白、球蛋白、清蛋白、醇蛋白，其中谷蛋白含量高达70%。核桃蛋白中含有18种氨基酸，其中有8种人体必需氨基酸，精氨酸和谷氨酸含量很高。近年来，关于核桃分离蛋白（WNPI）特性的研究较多，研究发现核桃分离蛋白的溶解性较差，核桃分离蛋白可以作为一种表面活性剂，它能提高乳状液稳定性，其乳化性和乳化稳定性受pH、离子浓度、温度、蛋白质浓度等影响。核桃产品的加工多以核桃仁的加工为主，产品类型相对比较简单，如核桃粉、核桃乳、核桃发酵乳、核桃酱等，希望通过对核桃分离蛋白的溶解性、乳化性及乳化稳定性进行研究，为提高核桃产品的附加值，扩大核桃分离蛋白在食品行业的应用提供一定的理论依据。
（一）材料与仪器
1.实验材料
核桃（食品级）：西安市农贸市场；石油醚（分析纯）：天津市天力化学试剂有限公司；无水氯化钙（分析纯）：天津市天力化学试剂有限公司；氯化钠（分析纯）：天津市天力化学试剂有限公司；磷酸（分析纯）：天津市天力化学试剂有限公司；阿拉伯树胶粉（分析纯）：天津市天力化学试剂有限公司；磷酸氢二钠（分析纯）：天津市科密欧化学试剂有限公司；磷酸二氢钠（分析纯）：天津市科密欧化学试剂有限公司；十二烷基磺酸钠（SDS）（分析纯）：天津市科密欧化学试剂有限公司；考马斯亮蓝G250（分析纯）：北京爱普华美生物科技有限公司；牛血清蛋白（生物试剂）：上海源叶生物科技有限公司。
2.实验仪器
精密pH 计，P B-10型：赛多利斯科学仪器北京有限公司；电子天平，JA5003B型：上海精科天美科学仪器有限公司；磁力搅拌器，84-1型：上海梅颖浦仪器仪表制造有限公司；超细匀浆器，F6/10-G型：上海弗鲁克流体机械制造有限公司；离心机，H1850型：湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；分光光度计，UV759S型：上海荆和分析仪器有限公司；涡旋振荡器，QL901型：海南市其林贝尔仪器制造有限公司；电热鼓风恒温干燥箱，GZX-GF101-1-BS型：上海跃进医疗器械有限公司；循环水真空泵，SHZ-Ⅲ型：上海亚荣生化仪器厂；料理机，JYL-C020型：九阳股份有限公司。
（二）实验方法
1.核桃仁、核桃脱脂粉及核桃分离蛋白（WNPI）基本成分测定
（1）蛋白质含量测定 依据GB 5009.5-2016测定，凯氏定氮法（核桃蛋白转换系数为5.3）。
（2）脂肪含量测定 依据GB 5009.6-2016测定，索氏抽提法。
（3）水分测定 依据GB 5009.3-2016测定，直接干燥法。
（4）灰分测定 依据GB 5009.4-2016测定，干法灰化法。
2.核桃分离蛋白的制备
核桃去壳，核桃仁水中浸泡去皮，核桃仁于40℃干燥并粉碎，核桃粉末经石油醚脱脂处理[料液比1∶6（g/mL），脱脂2次]，抽滤，溶剂挥发后过40目筛。核桃脱脂粉末与水以1∶15（g/mL）料液比混合，0.5mol/L NaOH调节溶液pH 9.0，磁力搅拌器匀速搅拌1h，5000r/min离心10min，收集上清液，沉淀再用1∶5（g/mL）的料液比提取2次；将上述收集得到的所有上清液用0.5mol/L HCl调节溶液至核桃分离蛋白等电点pI5.0，5000r/min离心10min，收集得到沉淀并水洗5次，冷冻干燥备用。
3.核桃分离蛋白溶解性测定
准确称取0.2g蛋白质溶解于40mL磷酸缓冲溶液或一定浓度NaCl、CaCl2、阿拉伯胶的磷酸缓冲溶液，用0.5mol/L 的NaOH 或0.5mol/L 的HCl调节pH，磁力搅拌1h，5000r/min离心10min后备用，取样品溶液20μL，补水至100μL，加入5mL考马斯亮蓝，涡旋振荡器上混匀，于595nm处测定吸光度。蛋白溶解性计算公式：
4.核桃分离蛋白乳化性及乳化稳定性的测定
准确称取0.09g蛋白质溶解于45mL磷酸缓冲溶液或一定浓度NaCl、阿拉伯胶的磷酸缓冲溶液（pH 7.0，10mmol/L），用0.5mol/L的NaOH或0.5mol/L的HCl调节pH，磁力搅拌1h，加入10mL大豆油，手持超细匀浆机35000r/min均质2min，从乳化液底部快速抽取50μL液体，加入10mL 0.1% SDS溶液，迅速摇晃使其分布均匀，于波长500nm处测定吸光值，此吸光值为0min时样品的乳化活性指数，用A0表示；静置10min后再吸取1次乳化液进行如上操作，此时吸光值作为10min时样品的乳化活性指数，用A10表示。
式中 T——2.303
C——蛋白质溶液的浓度
Φ——油相的体积比
A0——0min时在500nm处的吸光值
式中 A10——10min后在500nm处的吸光值
（三）结果与讨论
1.核桃仁、核桃脱脂粉及核桃分离蛋白基本成分分析
核桃仁、核桃脱脂粉及核桃分离蛋白的主要成分见表7-4。
表7-4 核桃仁、核桃脱脂粉及核桃分离蛋白的主要成分
2.不同因素对核桃分离蛋白溶解性影响
（1）pH影响pH对溶解度的影响如图7-13所示，核桃分离蛋白的溶解性整体呈现出一个U形曲线，与其他蛋白质溶解性曲线相似，由图7-13还可以看出，其等电点pI在5.0左右，当pH在等电点附近，蛋白质溶解性较低，偏离等电点越远，核桃分离蛋白的溶解性越好。当核桃分离蛋白处于等电点时，其自身的静电荷为零，蛋白之间的静电排斥力较低，导致蛋白相互聚集而产生沉淀，从而降低了溶解度。碱性条件中核桃分离蛋白的溶解性略微高于酸性条件。这可能是因为在偏离等电点的酸性和碱性条件下，蛋白带正电或负电，与水分子之间的相互作用增强，溶解度增加。
图7-13 pH对核桃分离蛋白溶解度的影响
（2）NaCl影响NaCl对溶解度的影响如图7-14所示，由图7-14（1）、图7-14（2）可以看出，NaCl的加入降低了溶解性。不同pH条件下，核桃分离蛋白的溶解性随NaCl浓度的增加而减小，这是由于NaCl加入中和蛋白质所带电荷，破坏了蛋白质表面的水膜，从而降低了蛋白质的溶解度。碱性条件下NaCl对核桃分离蛋白溶解性的影响较酸性条件更大。这可能是因为pH 3.0和pH 8.0时，蛋白质分别带正负两种不同的电荷，引入NaCl使蛋白质溶解性表现出两种不同的变化趋势。
图7-14 NaCl对核桃分离蛋白溶解度的影响
（3）CaCl2影响 图7-15所示为CaCl2对溶解度的影响，由图7-15（1）、图7-15（2）可以看出，CaCl2的引入降低了蛋白质溶解性。当pH 3.0和pH 8.0时，在0～60mmol/L的浓度范围内，溶解度随CaCl2浓度的增加而减小。这是因为CaCl2的引入中和蛋白所带电荷，破坏了蛋白表面的水化层，使体系变得不稳定，蛋白更容易絮凝沉淀。从图7-15（1）、图7-15（2）还可以看出，酸性条件下CaCl2对核桃分离蛋白溶解性的影响较碱性条件更小。这可能是因为不同pH条件，蛋白质所带电荷性质和数量不同，CaCl2加入会产生不同影响。图7-15（1）、图7-15（2）与图7-14（1）、图7-14（2）比较可以得出，CaCl2较NaCl对蛋白质溶解性的影响更加明显。根据阳离子降低溶解度能力规律，Ca2+降低溶解度的能力大于Na+。
图7-15 CaCl2对核桃分离蛋白溶解度的影响
（4）阿拉伯胶影响 阿拉伯胶对溶解度的影响如图7-16所示，由图7-16（1）、图7-16（2）可知，加入阿拉伯胶会降低蛋白质的溶解性。pH 3.0和pH 8.0下，在0.00%～0.20%的浓度范围内，蛋白质的溶解度随阿拉伯胶浓度的增加而减小，这可能是因为阿拉伯胶本身是一种亲水性的胶体，会与蛋白质竞争性地与水结合，导致蛋白溶解性降低。从图中还可以得出，pH 3.0时蛋白溶解度下降趋势更明显。pH 3.0时蛋白质带正电，阿拉伯胶是一种弱酸性大分子多糖，带负电，与蛋白表面电荷中和，导致蛋白质发生沉淀，从而使溶解度降低。
图7-16 阿拉伯胶对核桃分离蛋白溶解度的影响
3.不同因素对核桃分离蛋白乳化性和乳化稳定性的影响
（1）pH影响pH对乳化性和乳化稳定性的影响如图7-17所示，由图7-17可以看出，乳化性和乳化稳定性整体表现出先降低后上升的趋势。pH 5.0左右，蛋白质乳化性和乳化稳定性都较差，pH＜5.0时，乳化性和乳化稳定性随pH增加而减小，pH＞5.0时，乳化性和乳化稳定性随pH的增加而增加。原因是核桃分离蛋白的等电点在pH 5.0左右，此时蛋白质自身静电荷为零，蛋白质之间的静电排斥相互作用较弱，蛋白质容易絮凝聚集，溶解性最小，蛋白质向油水界面的界面吸附量少，吸附能力弱，乳化性和乳化稳定性较低，偏离等电点的环境下，蛋白质的溶解性提高，有助于提高蛋白界面载量和高黏弹膜的形成，提高了乳化性和乳化稳定性。
图7-17 pH对核桃分离蛋白乳化性和乳化稳定性的影响
（2）NaCl的影响NaCl对乳化性和乳化稳定性的影响如图7-18所示，由图7-18（1）、图7-18（2）可以看出，加入NaCl后核桃分离蛋白的乳化性和乳化稳定性整体呈下降趋势。pH 3.0和pH 8.0条件下，在0～100mmol/L浓度范围内，随NaCl浓度增加，核桃分离蛋白的乳化性和乳化稳定性降低。可能是由于NaCl的引入中和了蛋白质表面所带电荷，蛋白质水化层遭到破坏，蛋白质溶解性下降，因此，吸附在油水界面的蛋白质的量减少，导致乳化性、乳化稳定性降低。
图7-18 NaCl对核桃分离蛋白乳化性和乳化稳定性的影响
（3）阿拉伯胶的影响 阿拉伯胶对乳化性和乳化稳定性的影响如图7-19所示，由图7-19（1）、图7-19（2）可以看出，不论是pH 3.0或pH 8.0，加入阿拉伯胶均会使核桃分离蛋白的乳化性增加，且pH 3.0比pH 8.0乳化性更好，由于阿拉伯胶结构上带有部分蛋白物质及结构外表的鼠李糖，使得阿拉伯胶有优良的亲水亲油性，能在油滴周围形成一层厚的、具有空间稳定性的大分子层，是非常好的天然水包油型乳化剂，所以阿拉伯胶的引入会明显增加蛋白质的乳化性。从图7-19（1）、图7-19（2）还可以得出，在0.00%～0.20%的浓度范围内，阿拉伯胶浓度使蛋白质乳化稳定性呈先减少后增加的趋势。
图7-19 阿拉伯胶对核桃分离蛋白乳化性和乳化稳定性的影响
（四）小结
核桃仁去皮、粉碎、脱脂，对石油醚脱脂后的核桃脱脂粉采用碱溶酸沉法提取得到核桃分离蛋白，最终蛋白纯度达到80.32%，油脂含量降低至2.78%。本章节研究了pH、NaCl、CaCl2、阿拉伯胶对WNPI溶解度的影响，同时探究了pH 3.0、8.0条件下，不同浓度NaCl、阿拉伯胶对WNPI乳化性和乳化稳定性的影响，以及不同pH条件下WNP I乳化性和乳化稳定性的变化。主要结论如下。
（1）WNPI溶解度曲线在pH 2.0～10.0呈现出一个U形曲线，pH 5.0为其等电点，此处溶解度最低。pH 3.0和pH 8.0条件下，引入NaCl、CaCl2、阿拉伯胶均会降低蛋白质的溶解度，碱性环境中NaCl、CaCl2对WNPI溶解度影响更明显，且CaCl2对溶解度改变程度更大，阿拉伯胶对酸性环境中WNPI的影响更大。
（2）WNPI的乳化性和乳化稳定性在pH 2.0～10.0先减小后增加，在等电点处最低，碱性条件下乳化性和乳化稳定性比酸性条件下高。不同pH 条件下，NaCl的引入会降低蛋白的乳化性和乳化稳定性，阿拉伯胶浓度从0.00%增加到0.20%过程中，乳化性提高，乳化稳定性先下降后上升。
二、超声对核桃分离蛋白性质的影响
近年来，随着消费者对绿色营养食品关注度的提高，植物蛋白质作为功能性成分应用于食品中的实例日益增加。蛋白质在食品生产中被广泛用作胶凝剂、发泡剂、稳定剂和乳化剂。核桃蛋白质是核桃油生产过程中的副产物，通常用作动物饲料或被丢弃，严重浪费了优质的核桃蛋白质资源。然而，谷蛋白是核桃蛋白中发现的主要组成部分（≈70%），其难溶于水的性质限制了核桃蛋白在许多食品中的应用。因此，选用超声的方法来改善核桃蛋白质的理化性质，以达到其在食品的加工生产中广泛应用的目的。
目前，超声波技术已广泛应用于食品加工产业，超声技术在食品工业中的应用分为两类。
（1）高频率（MHz），低能量（小于1W/cm2）的检测超声波；
（2）低频率（kHz），能量高（10～100W/cm2）的功率超声波。
高频超声主要利用超声波的声速、衰减系数和声学阻抗来反映食品体系物化特性，如罐装饮料的液面高度测定、控制食品物料流速等方面。而低频超声技术，是利用超声振动能量能在介质中产生空化效应、机械效应及热效应的综合作用，来改变或者加速改变物质组织结构、状态、功能。常被用于天然物质如多糖、蛋白质的提取；食品的灭菌（最大程度地保护食品的颜色、风味、质地）；降解水体微生物难以处理的有机污染物。低频超声技术在蛋白质的改性方面近年来也有应用，Zhou等研究超声对大豆球蛋白的影响时发现超声会改变大豆球蛋白的粒径，增加溶解性、表面疏水性。Resendiz-Vazquez等在对木菠萝籽分离蛋白的研究中发现，超声提高了蛋白质的乳化性和乳化稳定性，增加了起泡性和泡沫稳定性。Arzeni等发现超声处理蛋清蛋白后，其表面疏水性增加，但是总的巯基含量不会改变。
蛋白质的结构和功能特性之间有着密切的关联，本节对经过超声处理的核桃蛋白功能性质、结构变化进行研究，以期获得一种改善核桃蛋白加工性能的新方法，为优质核桃资源的有效利用提供新思路。
（一）材料与方法
1.实验材料与试剂
核桃分离蛋白：实验室自制；β—巯基乙醇（分析纯）：北京爱普华美生物科技有限公司；丙烯酰胺（分析纯）：天津市科密欧化学试剂有限公司；甲叉双丙烯酰胺（分析纯）：天津市科密欧化学试剂有限公司；考马斯亮蓝R250（分析纯）：北京爱普华美生物科技有限公司；冰醋酸（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；甲醇（分析纯）：天津大茂试剂有限公司；5，5′二硫代双（2—硝基苯甲酸）（DTNB）（分析纯）：Sigma公司；四甲基乙二胺（TEMED）（分析纯）：Sigma公司；乙二胺四乙酸二钠（分析纯）：天津市致远化学试剂有限公司；甘氨酸（Gly）（分析纯）：上海化学试剂公司；三羟甲基氨基甲烷（Tris）（分析纯）：上海化学试剂公司；蛋白质标准品Mark（14.4～97.2ku）：上海源叶生物有限公司；大豆油：益海嘉里食品有限公司；透析袋（2000u）：上海源叶生物有限公司。
2.主要实验仪器
精密pH计，PB-10型：赛多利斯科学仪器北京有限公司；电子天平，LE204E/02型：梅特勒—托利多有限公司；磁力搅拌器，84-1型：上海梅颖浦仪器仪表制造有限公司；超细匀浆器，F6/10-G型：上海弗鲁克流体机械制造有限公司；离心机，H1850型：湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；分光光度计，UV759S型：上海荆和分析仪器有限公司；涡旋振荡器，QL901型：海南市其林贝尔仪器制造有限公司；超声微波紫外催化合成仪，XH-300UA型：北京翔鹄科技有限公司；荧光光谱仪，FS5型：爱丁堡仪器有限公司；圆二色光谱仪，J-810型：日本JASCO公司；激光粒度分析仪，Mastersizer 2000型：英国Malvern仪器有限公司；扫描电镜，FEI Q45+EDAX Octane Prime型：美国FEI和EDAX；差示量热扫描仪，DSC-25型：美国TA 仪器；电泳仪，165-8001型：美国伯乐公司；凝胶成像仪，FR-980A 型：上海福复日科技有限公司。
（二）实验方法
1.样品的超声波处理
WNPI粉末分散于磷酸盐缓冲溶液（10mmol/L，pH 7.0）中，配制成浓度0.5%（质量浓度）的WNPI溶液，0.5mol/L NaOH或HCl调节溶液pH至8.0，室温搅拌60min使其充分溶解，再将200mL溶液转移进入250mL石英玻璃烧瓶中，使用装有直径1.8cm的钛探针的超声微波紫外催化合成仪对溶液进行超声处理，超声条件：0，200，400，600W，15，30min（脉冲持续时间：工作2s，停止1s）。
2.粒度测定
超声处理WNP I样品的平均粒径和粒度分布采用激光粒度分析仪测量，该仪器可以检测直径在0.02～2000μm范围内的颗粒。将超声处理后的WNPI样品加入含有700mL去离子水的搅拌测量池中，直至遮光度达到10%～15%，以避免多重散射效应。平均粒径表示为体积平均直径（D43）和表面平均直径（D32）。
3.扫描电镜观察（SEM）
使用扫描电子显微镜（SEM）测定冷冻干燥后WNPI粉末样品的微观结构。将样品均匀分布在导电胶上，然后用离子溅射仪在氩气氛围下喷金，25kV的电子加速电压下拍摄样品的图像。
4.溶解性的测定
测定方法参见本节“一”。
5.乳化性和乳化稳定性的测定
测定方法参见本节“一”。
6.差示量热扫描（DSC）
参照Yin等人的方法稍作修改，采用差示扫描量热仪分析WNP I及超声处理WNPI样品的热稳定性。准确称量未处理和超声处理的WNPI样品（～2mg）于铝盘中，向其中加入10μL磷酸缓冲液（10mmol/L，pH 7.0），压盒密封，空铝盘作参比。样品在20℃下平衡2min，然后以20℃/min的速率从20℃加热升温至140℃。由专用仪器软件（TRIOS）分析热曲线得出热变性温度（Td）和热变性焓（ΔH）。
7.SDS-PAGE
还原和非还原十二烷基磺酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）测定未处理和超声处理的WNP I分子结构，参照Liu等人的方法稍作修改。对于还原型电泳，20mL 10% SDS，50mL去离子水，5mLβ—巯基乙醇，2.5mL 4%（质量浓度）溴酚蓝，12.5mL 0.5mol/L Tris-HCl缓冲液（pH=6.8）和10mL甘油混合，配制100mL样品缓冲液待用。然后将400μL 蛋白质溶液（2.5mg/mL）、400μL样品缓冲液和400μL 去离子水混合制备蛋白质样品。混合后的蛋白质样品在95℃加热煮沸5min，每个泳道加入蛋白质样品10μL。对于非还原型电泳，不添加β—巯基乙醇。5%浓缩凝胶，15%分离凝胶，使用配备Smart View软件的凝胶成像仪拍摄图像。
8.圆二色谱（CD）
圆二色谱（CD）用来分析超声处理前后WNPI二级结构的变化。将未处理和超声处理的WNPI 溶解于磷酸缓冲溶液中（10mmol/L，pH 7.0），配制成0.1mg/mL WNPI溶液，注入0.1cm厚的样品池中，采用Jasco J-810圆二色谱仪测定WNPI溶液的far-UV圆二色谱变化。扫描范围：190～250nm，扫描速率：100nm/min，响应时间0.25s，带宽：1.0nm，八次扫描的平均值作为一个谱图。在光谱分析之前，从样品CD 光谱中扣除空白样品的CD 光谱，使用由Jasco Corp.提供的Yang-Us，jwr软件分析蛋白二级结构：α—螺旋，β—折叠，β—折叠和无序卷曲。
9.表面游离巯基测定
游离巯基含量的测定参照Zhao等的方法稍作修改，Ellman′s试剂的配制：4mg DTNB试剂加入到1mL Tris-gly缓冲溶液（0.086mol/L Tris，0.09mol/L Gly，4mmol/L EDTA，pH 8.0）。冷冻干燥后的WNPI样品溶解于Tris-gly缓冲溶液中（0.15%质量浓度），50μL Ellman′s试剂加入至5mL蛋白质溶液中，然后在（25±1）℃条件下振荡水浴1h，在室温条件下将稀释后的样品溶液以转速10000×g离心10min。最后于412nm处测定吸光度。不含蛋白质的缓冲溶液作试剂空白，以摩尔消光系数13600L/（mol·cm）计算游离巯基含量，结果以μmol/g蛋白质来表示。
10.内源荧光光谱
未处理和超声处理的WNP I 溶液（0.5%质量浓度）用磷酸盐缓冲液（10mmol/L，pH 7.0）稀释至1.5mg/mL，在室温条件下，将稀释后的样品溶液以转速10000×g离心10min，然后采用FS-5型荧光光谱仪测定WNPI内源荧光，激发波长295nm，发射光谱扫描范围为300～400nm，狭缝宽度2.5nm，激发和发射的带宽分别为3nm和2nm。
（三）结果与讨论
1.粒度分布
未处理和超声处理WNPI分散液的粒度分布和平均粒径（D43、D32）如图7-20、表7-5所示。未处理样品的粒度分布相对较宽，主要分布在0.8～160μm，最高峰出现在3μm附近，这表明未经处理的WNP I分散液含有许多大的蛋白质聚集体。超声处理导致粒度分布变窄，平均粒径呈下降趋势。经600W 15min超声处理后D43从17.8μm下降至1.2μm，粒径减小可能是由超声波探针产生的空化、湍流和剪切力效应引起，这些作用会破坏一些较大的不溶性蛋白质聚集体。该现象与学者们对大豆蛋白和乳清蛋白的研究结果一致。研究中还发现过度的超声处理可能导致已经被分散的蛋白质聚集体重新聚集，样品经600W 30min超声处理比600W 15min处理后平均粒度更高。这种现象可能是由于过度超声使蛋白质结构变得特别舒展，促进蛋白质聚集。因此，应优化超声处理条件，适度破坏蛋白质聚集体。
图7-20 不同超声处理条件下WNPI的粒径分布
表7-5 不同超声处理条件下WNPI的平均粒径（D43、D32）
2.WNP I的微观结构
超声处理前后WNPI粉末的微观结构信息如图7-21所示。SEM图像显示超声处理的WNP I粉末倾向于形成较薄的不规则片状结构，未经处理的对照样品片状结构完整，尺寸更大。从图7-21中还可以看出，在最高超声功率（600W）条件下，超声30min的样品比15min的样品具有更大的片状结构，表明长时间处理过程中有较大蛋白质聚集体形成，该结果与上述粒径的变化情况一致。结果表明超声处理会改变蛋白质溶液在冷冻干燥过程中形成粉末的微观结构，可能会对其功能特性产生影响。
3.WNP I的溶解性
蛋白质良好的溶解性对其在食品工业中的应用有着重要作用，蛋白质的溶解性与功能特性密切相关，如乳化、增稠和凝胶特性，因此，研究超声处理对WNPI溶解性的影响很重要。超声对蛋白质溶解度的影响如图7-22所示。在相对低强度的功率和短时间的超声处理（200W 15min）条件下，未处理和超声处理的样品之间的蛋白质溶解度没有显著差异（p＞0.05）。当超声功率更大和超声处理时间更长时，WNPI溶解度显著增加。在600W 15min的超声处理条件下，WNPI 溶解度达到最高（93.2%），明显高于未处理的对照样品（76.4%）。这是因为使蛋白质分子聚集在一起的一些物理作用力遭到高强度超声的破坏，释放出较小的可溶性蛋白质聚集体。另外，超声处理可能会引起单个蛋白质分子结构和表面化学性质的改变，从而提高水溶性。研究人员对其他类型的蛋白质也进行了研究，如乳清蛋白、大豆蛋白和肉蛋白，并得到了相似的结论。
图7-21 超声处理后WNPI微观结构的变化
图7-22 不同超声处理条件下WNPI的溶解度
A—未处理 B-200W 15min C-200W 30min D-400W 15min E-400W 30min F-600W 15min G-600W 30min
4.乳化性及乳化稳定性
蛋白质的乳化性对许多食品（包括饮料、酱料、调味品、甜点、蘸料和面糊）的加工生产很重要。超声处理前后WNPI乳化特性的变化如图7-23所示。从图7-23中可以得出，超声处理的WNPI样品EAI显著高于未处理的对照样品（p＜0.05），随着超声功率增强，超声时间延长，EAI 逐渐增加，样品在600W 30min超声处理后，EAI从35.4m2/g增长到最大44.7m2/g，表明超声处理能促进以WNPI为乳化剂的乳液形成，引起蛋白质EAI增加。这可能是因为较大比例可溶性蛋白质吸附到油/水界面，或者是超声诱导蛋白质表面化学性质发生变化。
从图7-23中同时还可以看出，所有超声处理的WNPI样品ESI也高于未处理样品，说明超声处理增强了乳液的稳定性。600W 15min超声处理WNPI样品与未处理样品相比，ESI从（23.0±1.3）min提高至（32.2±0.8）min。ESI增加可能是因为在超声处理后蛋白质作为乳化剂形成乳液的液滴较小，或者是油滴表面化学性质改变引起液滴之间吸引/排斥相互作用的变化。经600W 30min超声处理后，WNPI的ESI有所降低，这是由于过度超声处理反而引起了大量解折叠的蛋白质重新聚集。
图7-23 超声处理对WNPI乳化性、乳化稳定性影响
A—未处理 B-200W 15min C-200W 30min D-400W 15min E-400W 30min F-600W 15min G-600W 30min
研究人员也发现超声处理可以提高不同种类蛋白质的乳化性能，包括卵蛋白、大豆蛋白和花生蛋白。超声处理引起蛋白质结构和表面化学性质变化，从而改善蛋白质乳化特性，蛋白质的乳化性质与其表面疏水性密切相关，优良的表面疏水性能确保蛋白质良好的水溶性和表面活性。超声促进球状蛋白质结构的部分展开，使原本存在于疏水内部的一些非极性基团暴露到周围的水相环境当中，增加蛋白质表面活性。
5.热稳定性分析
采用差示扫描量热法测量蛋白质热稳定性获取蛋白质构象的信息。DSC测定未处理和超声处理WNP I的热学特性如表7-6所示。未经处理的WNP I的变性温度Td=（115.87±0.02）℃，热变焓ΔH=（67.28±0.01）J/g，经超声处理的样品Td、ΔH降低，200W 15min超声处理后可以得到明显改变，Td=（109.69±0.30）℃，热变焓ΔH=（1.53±0.05）J/g。这表明即使采用最温和的超声处理，大部分蛋白质也发生了变性。随着超声功率和时间的增加，Td和ΔH稍微有所降低，表明变性程度仍在增加，600W 30min超声处理后达到最低，Td=（108.41±0.19）℃，热变焓ΔH=（1.22±0.03）J/g。其他研究发现，超声后乳清蛋白发生变性，热变焓降低，表明超声波处理使蛋白质的结构变松散，但是，并没有发现其Td有明显变化。在有关蛋清蛋白的研究报道中发现，超声处理后蛋白质Td和ΔH均没有明显变化。这些结果的差异可能与蛋白质种类、环境和超声处理条件有关。
表7-6 超声处理对WNPI热稳定性影响
6.SDS-PAGE
还原和非还原电泳可以反映未处理和超声处理WNP I的分子质量大小，进而获得超声处理对WNP I分子特征影响的信息。图7-24为超声处理前后WNP I样品在还原和非还原条件下的SDS-PAGE图。
从还原电泳图（图7-24A）可以看出，所有样品均呈现出五条明显条带，分子质量分别为44.1～62.0ku（a），35.2～39.4ku（b），21.0～27.9ku（c），～14.4ku（d），8.6～9.8ku（e），这与Sze-Tao等对WNP I的研究结果一致。与对照（L1）相比，超声处理蛋白质样品（L2～L7）的主要条带均没有发生明显变化，这表明超声处理没有引起肽键的断裂。但是，超声处理样品的电泳条带颜色明显加深，这可能与WNP I 溶解性的改善有关。研究发现超声处理后并不会改变大豆蛋白的分子质量，相反，也有研究报道超声处理会造成蛋白质的碎裂，如菠萝蜜种子蛋白和α—白蛋白。这些结果表明超声引起蛋白质分子质量的变化情况可能取决于蛋白质类型、溶剂种类和超声处理条件。
图7-24 超声处理前后WNPI的电泳图谱
A为还原电泳，B为非还原电泳，1～7：（未处理，200W 15min，200W 30min，400W 15min，400W 30min，600W 15min，600W 30min）
在非还原条件下，超声处理前后WNP I样品的电泳图谱也没有明显差异（图7-24B），表明超声处理没有破坏任何二硫键，进一步证实了本研究中超声处理没有引起蛋白质分子产生碎裂的现象。同时，对比还原和非还原条件下电泳图谱发现，相同的蛋白质样品之间存在差异。非还原电泳图中，分子质量约14.4ku（d）和8.6～9.8ku（e）范围内的条带颜色变浅，44.1～62.0ku（a）条带的颜色加深，产生这种现象的原因可能是加入β—巯基乙醇后破坏了多肽复合物之间的二硫键，导致小分子质量的多肽形成。
7.二级结构
蛋白质或多肽圆二色谱图之间的差异与其二级结构紧密相关，α—螺旋结构特征峰：192nm一个正峰，222nm和208nm两个负的特征肩峰；β—折叠结构特征峰：216nm一个负谱带，185～200nm一个正谱带；β—转角结构特征峰：206nm一个正谱带；左手螺旋P2结构在相应的位置有负的谱带。α—螺旋和β—折叠为蛋白质二级结构的有序结构，具有高度稳定性。蛋白质的无序结构以β—转角和无规卷曲为主。超声处理前后WNP I的圆二色谱图如图7-25所示，从图中可以看出超声处理后蛋白质特征峰发生了变化。表7-7反映了未处理和超声处理的WNP I样品的α—螺旋、β—折叠、β—转角和无规卷曲所占的比例。可以看出超声处理对蛋白质的二级结构有轻微的影响，增加超声强度和持续时间后，α—螺旋含量降低，β—折叠、β—转角和无规卷曲含量增加。蛋白质二级结构通过各种类型的氢键维持，超声处理可能破坏了某些类型的氢键，导致部分α—螺旋结构转化为β—转角、β—折叠或无规卷曲结构。有关黑豆蛋白质和鸡肌原纤维蛋白质的研究中也有类似发现。也有学者提出，低功率超声处理会降低大豆蛋白中α—螺旋和无规卷曲的比例，而高功率超声处理得到的结果却相反。这些结果的差异可能与蛋白质类型、溶剂环境和超声条件有关。
图7-25 超声处理后WNPI圆二色谱图
表7-7 不同超声处理对WNPI二级结构的影响
8.游离巯基含量
位于WNPI表面的游离巯基（SH）含量的变化可以反映超声处理引起蛋白质分子结构的改变。如图7-26所示，超声后WNPI的游离SH含量增加，一方面，可能是因为超声处理破坏了蛋白质中的一些S-S键，促进新的SH形成，但是，超声处理后样品的电泳图谱却没有显示蛋白质相对分子质量的改变。另一方面，可能是超声处理过程中产生的空穴、机械、热效应促使蛋白质部分去折叠，使原本存在于蛋白质分子内部疏水结构的游离SH基团到达表面。从图7-26中还可以看出，随着超声强度的增加，游离巯基含量反而减少，这可以归因于长时间高强度超声处理产生的H2O2，敏感官能团如SH基团在H2O2的存在下极易被氧化，从而导致游离SH含量降低。研究人员已经发现，超声处理也可以增加卵蛋白和大豆蛋白的游离SH含量。也有研究报道超声处理会降低蛋白质的游离SH含量。不同研究中游离SH含量的变化可能与蛋白质类型、溶剂环境和超声处理条件的差异有关。
9.固有荧光光谱
蛋白质溶液固有荧光光谱可以提供更多关于超声处理后WNP I结构变化的信息。当蛋白质发生构象变化，色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸的分子环境改变时，WNP I的荧光光谱会发生变化。从图7-27中可以看出，未处理和超声处理样品产生最大荧光强度的荧光发射波长在329nm附近，最大荧光强度随着超声处理强度和时间的增加而降低，这表明超声处理后蛋白质结构或聚集状态发生了变化。超声处理过程中蛋白质三级结构的改变，引起苯酚基团所处环境的变化，最终导致蛋白质荧光强度降低。研究人员在探究超声对卵蛋白和大豆蛋白的固有荧光光谱的影响时发现，超声会降低蛋白质的荧光强度。本研究中，荧光光谱的测量结果与圆二色谱、游离巯基含量和DSC结果一致，表明超声处理会引起蛋白质结构的变化。
图7-26 超声处理后游离巯基含量图
A—未处理 B-200W 15min C-200W 30min D-400W 15min E-400W 30min F-600W 15min G-600W 30min
图7-27 超声处理条件下WNPI的内源荧光光谱图
（四）小结
本节主要研究了经超声处理后核桃蛋白的功能性质和结构变化，测定超声前后蛋白质溶解度、乳化性、乳化稳定性和表面游离巯基含量的变化，并通过圆二色谱、荧光光谱探究二三级结构，差示量热扫描分析蛋白热稳定性，SDS-PAGE研究蛋白质相对分子质量改变，激光粒度和扫描电镜了解蛋白质大小和微观结构，得出主要结论如下。
（1）超声处理后WNPI的溶解度明显提高，乳化性、乳化稳定性得到改善，但是过度的超声处理反而会使蛋白质的功能特性有所减低。
（2）与未处理WNPI相比，超声会使蛋白质部分变性，明显降低蛋白质稳定性。
（3）WNPI粒径在超声处理后显著降低，超声功率和时间增加到一定程度后，蛋白质分子重新聚集，粒径反而增加。
（4）还原电泳图和非还原电泳图显示，超声处理不会引起肽键的断裂，没有产生新条带，但条带颜色加深，这是因为蛋白质溶解度增加。
（5）圆二色谱显示增加超声处理强度和持续时间后，WNPI的α—螺旋含量降低，β—折叠、β—转角和无规卷曲含量增加。
（6）荧光色谱和游离巯基含量的变化说明WNPI在超声过程中三级结构发生变化，蛋白质分子疏水结构遭到破坏，变得更加松散。
（7）SEM图中未处理WNPI为完整片状结构，而处理后会有许多碎片产生。
三、糖基化对核桃分离蛋白性质的影响
糖基化反应即糖类化合物的还原性羰基与蛋白质的氨基在加热条件下所发生的羰氨缩合反应，该反应无须任何催化剂，是一种大幅度提高蛋白质功能特性的方法。小分子的单糖和双糖相较于多糖，更易与蛋白质的自由氨基发生糖基化反应，但是也容易产生类黑素等美拉德反应高级阶段产物，不利于改善蛋白质功能特性。对多糖而言，其空间位阻较大，形成的蛋白质—多糖接枝物具有较高的功能特性。麦芽糊精是一种价格低廉的淀粉水解产物，不仅溶解性、乳化性良好，黏度适中，具有很好的增稠效果，而且是一种没有任何味道的营养性多糖，很容易被人体吸收，可以作为基础原料生产病人和婴幼儿童食品，特别适合应用于食品加工生产中。
在总结前人对蛋白质糖接枝改性的研究中我们发现，糖接枝后的蛋白质各方面性质显示出明显变化，大豆蛋白和葡萄糖接枝产物在酸性和高浓度盐体系中的乳化特性得到很大程度改善；王军等研究表明鸡蛋清蛋白与低聚麦芽糖交联物的乳化特性没有变化，但是其抗氧化能力、溶解度和热稳定性均提高。采用超声辅助的方式加速玉米醇溶蛋白与葡萄糖、麦芽糊精的接枝反应，接枝物溶解度明显提高，表面疏水性降低，扫描电镜图显示，接枝物聚集结构明显减少，且呈现出大的片状结构。另外，影响糖基化反应的因素有很多，如pH、温度、缓冲体系、蛋白质和糖的比例等，不同因素对酪蛋白与葡聚糖接枝反应的影响程度大小为：酪蛋白浓度＞底物配比＞pH，Kasran等发现大豆乳清蛋白和葫芦巴胶以1∶1混合，生成的接枝物形成乳液的乳化稳定性最差。因此，需优化糖基化反应的条件，制备出功能特性高的接枝物。
本章节通过传统加热和超声两种方式制备核桃分离蛋白—麦芽糊精（WNPI-MD）接枝物，并对比研究了两种方式获得的接枝产物的接枝程度、颜色变化、功能特性以及二、三、四级结构的变化，以期为核桃蛋白应用领域的拓宽提供新的思路。
（一）材料与仪器(www.xing528.com)
1.实验材料与试剂
核桃分离蛋白（WNPI）：实验室自制；麦芽糊精（MD，食品级）：上海源叶生物有限公司；β—巯基乙醇（分析纯）：北京爱普华美生物科技有限公司；丙烯酰胺（分析纯）：天津市科密欧化学试剂有限公司；5，5′二硫代双（2—硝基苯甲酸）（DTNB）（分析纯）：Sigma公司；四甲基乙二胺（TEMED）（分析纯）：Sigma公司；甘氨酸（Gly）（分析纯）：上海化学试剂公司；三羟甲基氨基甲烷（Tris）（分析纯）：上海化学试剂公司；Mark（14.4～97.2ku）（分析纯）：上海源叶生物有限公司；透析袋（6～8ku）：上海源叶生物有限公司；邻苯二甲醛（OPA）（分析纯）：上海源叶生物有限公司；硼砂（分析纯）：天津市科密欧化学试剂有限公司。
2.主要实验仪器
精密pH 计，P B-10型：赛多利斯科学仪器北京有限公司；电子天平，LE204E/02型：梅特勒—托利多有限公司；超细匀浆器，F6/10-G型：上海弗鲁克流体机械制造有限公司；离心机，H1850型：湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；分光光度计，UV759S型：上海荆和分析仪器有限公司；超声微波紫外催化合成仪，XH-300UA型：北京翔鹄科技有限公司；荧光光谱仪，FS5型：爱丁堡仪器有限公司；圆二色光谱仪，J-810型：日本JASCO 公司；扫描电镜，FEI Q45+EDAX Octane Prime型：美国FEI和EDAX；电泳仪，165-8001型：美国伯乐公司；分光测色仪，CM-5型：日本柯尼卡美能达公司。
（二）实验方法
1.糖基化产物的制备
核桃分离蛋白（质量浓度1%），麦芽糊精（质量浓度1%）分散于磷酸缓冲溶液中（20mmol/L，pH 8.0），0.5mol/L NaOH 调节pH 至8.0。磁力搅拌1h，使二者混合均匀。对溶液进行传统加热和超声处理，传统加热条件：80℃，传统加热12h，24h；超声处理条件：80℃，超声功率200，400，600W，处理时间40min（脉冲持续时间：工作2s，停止1s）。经过处理后的溶液先冷却至室温，然后在4℃冰箱中透析24h，经透析处理过的样品冷冻干燥，样品4℃冰箱保存。
2.接枝度（DG）的测定
OPA法测定自由氨基，参照Vigo等人的方法稍作修改。配制OPA试剂（此试剂要现配现用），准确称取40.0mg的OPA溶解于1.0mL甲醇中，再加入20%（质量分数）十二烷基硫酸钠（SDS）2.5mL，硼砂（10mmol/L）25.0mL，β—巯基乙醇100μL，最后用蒸馏水定容到50mL。取4.0mL OPA试剂于试管中，加入200μL（2.0mg/mL）样品，混合均匀，于35℃水浴加热反应2min，在340nm下测吸光值。另取4.0mL OPA试剂于试管中，加入200μL水作为空白对照，用相同的方法，以赖氨酸代替样品作出标准曲线。
式中 A0——核桃分离蛋白和MD混合物的自由氨基酸含量
At——核桃分离蛋白和MD糖基化产物的自由氨基酸含量
A——核桃分离蛋白自由氨基酸含量
3.溶解性的测定
测定方法参见本节“一”。
4.乳化性及乳化稳定性的测定
测定方法参见本节“一”。
5.颜色变化
用色差计测定样品颜色的变化。样品置于透明自封袋中，放置在光滑黑色平板上，以此平板测量值为空白。色差仪提供3个色泽数值：L∗（黑—白值），a∗（红—绿值），b∗（黄—蓝值），接枝产物的色差ΔE可以由公式7-5计算得出。
式中 ΔL∗，Δa∗和Δb∗——样品与标准的色泽参数之间的差值
6.其他
SDS-PAGE、游离巯基含量测定、内源荧光光谱分析、圆二色谱（CD）、扫描电镜观察（SEM）的方法参见本节“二”。
（三）结果与讨论
1.接枝度
接枝度的大小可以反映传统加热和超声处理多糖的还原性末端和蛋白质自由氨基反应的程度。经传统加热和超声处理后WNP I与麦芽糊精的接枝度如图7-28所示，从图7-28中可以看出，延长传统加热处理时间，增加超声功率均能提高混合物的接枝度。控制反应温度80℃，与传统加热处理相比，超声处理的WNP I与麦芽糊精的混合物能在较短的时间内获得更高的接枝度，超声处理（200W/40min）比传统加热（24h）接枝度提高了近15.08%。有研究显示，超声所引起的空穴效应会产生高强度的剪切力、压力、温度、湍流，同时，超声能产生更高能量和更多自由基，促进分子的运动，促使蛋白质链伸展，蛋白结构变得更加松散，有利于蛋白质和多糖发生美拉德反应。Li等在研究花生蛋白与阿拉伯胶、葡聚糖接枝反应的过程中也发现与传统加热相比，超声处理更能促进糖接枝反应。
图7-28 传统加热（12，24h）与超声处理（200，400，600W，40min）对WNPI和麦芽糊精接枝度的影响
2.溶解度
不同pH条件下WNP I和WNP I-MD接枝物溶解度的变化如图7-29所示，从图7-29可以看出，WNP I及WNP I-MD接枝产物的溶解度均呈现出一个U形曲线，核桃分离蛋白及其接枝产物的等电点（pI）在5.0左右，当pH＞5，传统加热和超声处理后，WNP I-MD接枝产物的溶解性均呈现不同程度的提高，且pH=6.0时，与超声处理相比，传统加热对WNP I-MD接枝产物的溶解性影响更大。蛋白质的溶解性、蛋白质—溶剂（亲水）、蛋白质—蛋白质（疏水）相互作用之间平衡密切相关，WNP I接枝后其表面的亲水性/疏水性平衡的改变影响其溶解度的变化。MD是一种易溶于水的亲水性多糖。WNP I经过传统加热和超声处理后结构变松散，在发生美拉德反应的过程中WNP I与MD共价结合，使WNP I亲水性增加，同时抑制了WNPI与水分子间的疏水相互作用。Tang等发现芸扁豆蛋白和葡萄糖接枝产物的溶解度在偏离等电点的条件下会明显降低，这与本研究结果有一定差异，这可能与接枝物特性差异有关，其中芸扁豆蛋白在糖接枝后表面疏水性增加。pH＜5时，不同处理的WNP I-MD接枝产物的溶解性呈现不同程度的降低，且传统加热处理后，WNPI-MD接枝产物的pI向酸性条件偏移。这可能是因为WNP I表面的氨基与MD的羰基缩合，导致蛋白质表面氨基含量减少，所带负电荷相对增加，致使该条件下WNP I及其接枝物的溶解度降低。
图7-29 传统加热（12，24h）与超声处理（200，400，600W，40min）的WNPI-MD接枝物在不同pH条件下的溶解度
3.乳化性和乳化稳定性
WNP I及不同处理获得的WNP I-MD接枝产物乳化性及乳化稳定性如图7-30所示，由图7-30中归纳得出，WNP I在发生糖基化反应后乳化性和乳化稳定性都得到较大程度的改善。传统加热处理后，WNPI 的EAI 从35.37m2/g提高到74.71m2/g；超声处理后，WNPI的EAI增加到61.89m2/g，这是因为WNPI-MD溶解度增加，使在油水界面上吸附的蛋白质含量增加，且MD分子链较长，黏度较大，有利于在油水界面形成高黏弹的膜，促进乳液的形成。接枝物乳化稳定性也有所增加，这是因为WNP I-MD覆盖在油水界面上，减小了界面张力，使形成乳滴的尺寸更小。
由图7-30同时发现，超声处理后接枝物乳化性及乳化稳定性反低于传统加热，且乳化性及乳化稳定性随超声功率的增加呈现出减小的趋势，这是因为较好的乳化性和乳化稳定性需要界面达到良好的亲水亲油平衡，适度接枝有助于提高WNP I-MD的乳化性和乳化稳定性，与之相反，较高的接枝度会引入更多的亲水性基团，从而打破此平衡，导致乳化性和乳化稳定性的降低；另外，传统加热处理的WNP I-MD接枝物α—螺旋减少，无序结构增加，比超声处理得到的接枝物结构更加松散，蛋白质松散结构能提高乳化性和乳化稳定性。
图7-30 传统加热（12，24h）与超声处理（200，400，600W，40min）对WNPI-MD接枝物乳化性和乳化稳定性的影响
4.色泽
WNPI和不同处理得到的WNPI-MD色泽的变化见表7-8，由表7-8可知，处理后WNP I-MD的L∗值逐渐增加，a∗值减小，b∗值增加，ΔE值减小，超声处理后a∗、ΔE值减小幅度以及L∗、b∗值增加幅度明显高于传统加热。色泽是判断美拉德反应程度的重要特征指标，美拉德反应是一系列复杂的化学反应，该反应对产物的颜色、风味和结构造成重要影响，Moreles等发现大多数有颜色物质的产生主要发生在该反应的最后阶段，尽管由于糠醛或糖基化缩合在此阶段产生了无氮聚合物，但不饱和的棕色含氮聚合物和共聚物形成是该反应的主要特征。经处理后的接枝物 ΔE低于空白对照，可能是因为WNP I 与MD的反应正处在美拉德反应的初级阶段。传统加热和超声处理之间色泽的差异可能与两种处理方式下蛋白质与多糖反应机理不同有关，其中，超声处理过程中副反应比较少。从表7-8还可以看出，超声功率增加到600W，ΔE突然增加，这可能是因为超声功率过大，蛋白质与多糖反应迅速，有类黑素物质生成。
表7-8 WNPI和WNPI-MD接枝物的L∗、a∗、b∗和ΔE值变化
续表
5.SDS-PAGE
传统加热和超声处理的接枝物WNP I-MD与未处理的WNP I的还原电泳图如图7-31所示，WNP I 电泳图呈现出5个主要的条带，分子质量分别是44.1～62.0ku（a），35.2～39.4ku（b），21.0～27.9ku（c），～14.4ku（d），8.6～9.8ku（e）。从图7-31可以看出，与WNPI相比，经传统加热处理的WNPI-MD有新的条带约81.8ku（f）生成，a消失，c颜色明显变浅，这是因为加热处理过程中蛋白质的自由氨基和多糖的还原性末端共价结合，形成分子质量更大的蛋白质—多糖复合物；另外，蛋白质与蛋白质之间聚集也会生成大分子物质，a主要参与接枝反应，条带消失，c部分参与了接枝反应，导致蛋白质浓度降低，颜色变浅。超声处理的WNP I-MD和传统加热相比，也有新的条带f生成，a变化不明显，c颜色变更浅，而e颜色加深，这可能是因为两种不同处理导致蛋白质和多糖接枝反应机理有所差异，超声过程产生高能量、高压强以及湍流促使蛋白质的结构变化更加明显，导致较多的自由氨基从分子内部暴露，与多糖的羰基结合形成WNP I-MD接枝物，同时伴随着小分子质量物质的形成。
图7-31 接枝反应前后WNPI的还原电泳图谱
1：未处理；2～3：传统加热处理12，24h；4～6：超声处理200，400，600W，40min
6.游离巯基含量
WNP I及不同处理条件下获得的WNP I-MD接枝物游离巯基变化如图7-32所示，从图7-32可知，WNP I在发生接枝反应后巯基含量明显降低，且随传统加热时间延长以及超声功率提升而降低；另外，超声处理对巯基的影响较传统加热更大。这是因为巯基参与蛋白质的交联反应，形成二硫键，此外，多糖在与蛋白质发生糖基化反应时会改变蛋白质的结构，并导致部分的巯基被氧化。超声过程产生的空穴效应、热效应、机械效应会促使蛋白质链迅速延展，由刚性变为柔性，与多糖分子发生反应，因此，与传统加热相比，其反应效率更高，产物的接枝度也更高，巯基含量减少得更多。
图7-32 WNPI及不同处理的WNPI-MD接枝物游离巯基含量变化
7.荧光光谱分析
WNPI和WNPI-MD接枝物的内源荧光强度变化如图7-33所示，从图7-33可以看出，经传统加热处理的WNPI-MD接枝物荧光强度减弱，且加热时间越长，荧光强度越弱，经超声处理的WNP I-MD接枝物荧光强度随着超声功率的增大而减小；与超声处理相比，传统加热处理得到的WNP I-MD接枝物荧光强度更低。WNP I和WNP I-MD接枝物的荧光强度及发射波长与Trp残基的含量有关，WNPI的最大荧光发射波长在329nm处，而WNPI-MD接枝物最大荧光发射波长有红移的趋势（1～2nm），有更多的Trp暴露在溶剂环境中，说明经接枝反应后WNP I的三级结构变得松散。WNP I-MD接枝后荧光强度减弱，这可能是因为多糖链的存在对Trp荧光产生屏蔽，导致多糖链与蛋白质的接枝程度越高，其荧光减弱程度越大。图7-33同时显示，传统加热与超声处理WNP I-MD荧光强度存在差异，可能与两种处理WNP I与MD接枝方式不同有关；另外，SDS-PAGE图谱和CD光谱也同时验证了两种处理方式得到的接枝物结构上存在差异。
图7-33 传统加热（12，24h）与超声处理（200，400，600W，40min）对WNPI-MD接枝物内源荧光强度的影响
8.圆二色谱（CD）
经传统加热和超声处理的接枝物WNP I-MD与未处理的WNP I的圆二色谱图如图7-34所示，从图7-34可以看出，与未处理的WNPI相比，传统加热WNPI-MD接枝物在负峰的强度增加，超声处理的WNP I-MD接枝物在正峰的强度增加，且负峰有蓝移趋势（峰值波长变小）。WNP I-MD接枝物与WNP I的二级结构分析如表7-9所示，传统加热12h后，WNPI-MD接枝物的α—螺旋、β—转角含量急剧减小，β—折叠、无序结构增加，随着加热时间延长，α—螺旋、β—转角的含量稍微有所增加，分别为0.8%、0.2%左右，这种现象可能由以下因素引起：一方面，在加热的过程中蛋白质肽链断裂，结构变松散，与多糖接枝形成聚合物，该过程破坏了多肽链（-CO）和（NH-）间维持蛋白质二级结构稳定的氢键；另一方面，加热过程中蛋白质发生热变性，改变其结构。与空白对照相比，200W超声处理得到的WNP I-MD接枝物α—螺旋、β—转角含量较低；但是，随着超声功率的增加，WNP I-MD接枝物α—螺旋、β—转角含量反而增加，WNP I-MD的二级结构变得更加稳定，产生这种现象的原因可能与超声条件下WNP I-MD获得较高接枝度有关（＞50%），Tang等研究芸豆蛋白和葡萄糖接枝中发现，当蛋白质和糖的摩尔比为1∶100，分别加热2.5，5.0，10h，接枝物的α—螺旋增加，无序结构减少。
图7-34 WNPI和不同处理得到的WNPI-MD接枝物圆二色谱图
表7-9 糖接枝反应对WNPI二级结构的影响
9.扫描电镜（SEM）分析
经传统加热和超声处理的接枝物WNPI-MD与未处理的WNPI的1000×SEM图如图7-35所示，与未处理的WNPI 相比，传统加热（12h）和超声处理（200W）的接枝物片状结构更小，有不规则碎片产生，但随着加热时间延长以及超声功率的增加，WNP I-MD 接枝物的结构变得更加规整，片状结构更大、更薄。这是因为MD与WNP I通过共价键结合形成接枝物，接枝度越大，形成接枝物越均匀完整。
图7-35 接枝反应后WNPI微观结构的变化
（四）小结
研究了传统加热和超声处理两种方式对WNP I进行糖接枝改性，对比探究了两种处理方式处理得到的WNP I-MD接枝物与未处理WNP I之间的差异，包括功能特性、微观结构、分子质量大小和二三级结构的变化，得出主要结论如下。
（1）超声比传统加热更能促进糖接枝反应。
（2）两种方式处理制备的WNPI-MD接枝物溶解度都获得不同程度提高，且传统加热处理的接枝物等电点有向酸性条件偏移的趋势。
（3）WNPI-MD接枝物乳化性和乳化稳定性较未处理WNPI得到明显改善，但是WNP I接枝程度过高反而导致乳化性和乳化稳定性降低。
（4）WNPI-MD接枝物有新的大分子质量物质生成，且两种方式处理WNPI-MD接枝物的条带存在差异。
（5）WNPI-MD接枝物的片状结构更薄更大。
（6）传统加热后接枝物的α—螺旋、β—转角含量急剧减少，β—转角、无序结构含量增加，超声强度增加（400W、600W）后接枝物的α—螺旋、β—转角含量也随着增加。
（7）WNPI与麦芽糊精共价结合，固有荧光强度减弱，三级结构发生变化。
四、酶解对核桃分离蛋白性质的影响
核桃蛋白是一种优质的植物蛋白资源，具有相当高的营养价值，含有18种氨基酸，其中Lys和Glu含量尤其丰富，必需氨基酸含量均衡，生物利用率高。核桃蛋白氨基酸组成以疏水氨基酸和酸性氨基酸居多，导致其溶解性较差，限制了在食品生产加工中的应用。酶解改性条件温和、反应速度快、安全性高，不仅如此，酶解改性后蛋白质水解物还具有很多独特的理化特性、生物活性以及易消化吸收的特点。因此采用酶解的方式对核桃蛋白改性，使其结构一定程度上发生变化，且功能特性得到明显改善。Severrin等研究发现乳清蛋白经碱性蛋白酶和复合蛋白酶水解后游离氨基酸含量、溶解度均增加，随着水解度的增加，多肽的平均分子质量减小，未经处理的乳清蛋白乳化性和起泡性明显低于水解产物。薛洋等研究表明核桃蛋白的中性蛋白酶水解产物抗氧化能力增强，能明显抑制亚油酸的氧化。张然等发现中性蛋白酶酶解处理核桃蛋白后，其水解物溶解性增加，表面疏水性降低，乳化性、起泡性在适度水解条件下增加。郭浩楠等采用胰蛋白酶、风味蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、复合蛋白酶、碱性蛋白酶分别对鲢鱼肉蛋白酶解改性，对比研究发碱性蛋白酶水解效果最佳，同时得出限制性酶解鲢鱼肉蛋白能提高其乳化和起泡特性。
碱性蛋白酶是一种非特异性的肽链内切酶，催化作用位点较多，而胰蛋白酶特异性较强，仅作用于Lys和Arg。本章节对比研究了碱性蛋白酶和胰蛋白酶在最适宜的条件下，经相同时间处理后水解度、电位、荧光强度、微观结构、二级结构、游离巯基含量、SDS-PAGE、水解度、乳化性及乳化稳定性的变化情况，以期通过酶解改性的研究能够充分发掘出核桃蛋白这种潜在的功能性配料，为食品的加工生产提供新思路。
（一）材料与仪器
1.实验材料与试剂
碱性蛋白酶（食品级）：上海源叶生物有限公司；胰蛋白酶（食品级）：上海源叶生物有限公司；核桃分离蛋白：实验室自制；丙烯酰胺（分析纯）：天津市科密欧化学试剂有限公司；5，5′—二硫代双（2—硝基苯甲酸）（DTNB）（分析纯）：Sigma公司；甘氨酸（Gly）（分析纯）：上海化学试剂公司；三羟甲基氨基甲烷（Tris）（分析纯）：上海化学试剂公司；Mark（14.4～97.2ku）（分析纯）：上海源叶生物有限公司；透析袋（2000u）：上海源叶生物有限公司。
2.主要实验仪器
精密pH 计，P B-10型：赛多利斯科学仪器北京有限公司；电子天平，LE204E/02型：梅特勒—托利多有限公司；超细匀浆器，F6/10-G型：上海弗鲁克流体机械制造有限公司；离心机，H1850型：湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；分光光度计，UV759S型：上海荆和分析仪器有限公司；荧光光谱仪，FS5型：爱丁堡仪器有限公司；圆二色光谱仪，J-810型：日本JASCO公司；扫描电镜，FEI Q45+EDAX Octane Prime型：美国FEI和EDAX；电泳仪，165-8001型：美国伯乐公司；纳米表面电位分析仪，NANO-ZS90型：英国Malvern仪器有限公司；超级恒温器，501A型：上海实验仪器厂有限公司。
（二）实验方法
1.核桃分离蛋白碱性蛋白酶酶解产物的制备
制备底物浓度2%的核桃分离蛋白悬浊液，85℃加热预处理10min后，冷却至室温，0.5mol/L NaOH调节pH至8.0，按E/S=3%（酶/底物蛋白含量）的比例加入碱性蛋白酶，磁力搅拌，采用高温循环器加热维持恒定温度55℃，过程中滴加1.0mol/L NaOH 保持体系pH 不变，在反应时间分别为30，60，90min后结束，取出酶解液，85℃加热处理10min后终止酶解反应，冷却至室温，转速5000r/min条件下离心10min，上清液透析24h后冷冻干燥，保存待用。
2.核桃分离蛋白胰蛋白酶酶解产物的制备
制备底物浓度2%的核桃分离蛋白悬浊液，85℃加热预处理10min后，冷却至室温，0.5mol/L NaOH调节pH至8.0，按E/S=3%（酶/底物蛋白含量）的比例加入碱性蛋白酶，磁力搅拌，采用高温循环器加热维持恒定温度37℃，过程中滴加1.0mol/L NaOH 保持体系pH 不变，在反应时间分别为30，60，90min后结束，取出酶解液，85℃加热处理10min后终止酶解反应，冷却至室温，转速5000r/min条件下离心10min，上清液透析24h后冷冻干燥，保存待用。
3.水解度的测定
采用pH-Stat法测定，参照Adler-Nissen的方法稍作修改，酶解核桃分离蛋白的水解度，计算公式如7-6：
式中 DH——水解度，%
B——消耗碱液体积，mL
Nb——NaOH浓度，mol/L
α——α—氨基解离度
Mp——底物中的蛋白质质量，g
htot——底物蛋白质中肽键总数，mmol/g蛋白，核桃蛋白htot=7.35mmo1/g
4.溶解度的测定
测定方法参见本节“一”。
5.乳化性及乳化稳定性的测定
测定方法参见本节“一”。
6.表面电荷的测定
酶解处理后的样品溶解于磷酸缓冲溶液中（10mmol/L，pH 7.0），配成浓度为0.2%的蛋白质溶液，0.5mol/L NaOH或HCl调节pH 7.0，室温条件下采用ζ电位仪测定表面电荷含量。
7.其他
SDS-PAGE、游离巯基含量测定、内源荧光光谱分析、圆二色谱（CD）、扫描电镜观察（SEM）的方法参见本节“二”。
（三）结果与讨论
1.水解度
WNPI在Alcalase和Trypsin作用下水解30，60，90min后的水解度如图7-36所示，从图7-36可以看出，水解时间相同，Alcalase比Trypsin水解效果好，随时间延长，水解度逐渐增加，水解90min后，Alcalase水解度达到13.25%±0.74%，比相同条件下Trypsin高出约9%。这可能与WNPI的氨基酸组成和结构有关，Alcalase来源于微生物，是一种非特异性的肽链内切酶，催化作用位点较多，主要作用于含疏水性羰基如Phe、Tyr、Trp的肽键，而Trypsin来源于动物，特异性较强，仅作用于Lys和Arg，Alcalase较Trypsin的酶切位点更多，易于将大分子的蛋白质催化降解为小分子多肽。
图7-36 经Alcalase和Trypsin处理后WNPI的水解度
2.溶解度
WNPI在Alcalase和Trypsin作用下水解30，60，90min溶解度如图7-37所示，从图7-37可以看出，酶解能显著改善WNP I 溶解度，随酶解时间延长，WNP I溶解度增加。蛋白质的亲水性/疏水性、蛋白质分子间的静电排斥均与蛋白质的溶解度紧密相关，未处理的WNP I具有刚性的大分子结构，亚基由分子间和分子内的二硫键连接，经有限水解后，蛋白质分子质量降低，肽链折叠结构展开，可溶性蛋白质从不可溶的聚集体和沉淀中释放出来，水解处理同时增加了可解离氨基和羰基的含量，进而提高了WNP I水解物的溶解；另外，水解处理后，WNP I有序结构减少，无序结构增加，这可能也与水解物溶解度的改善有关。从图7-37还可以看出，与Trypsin处理相比，Alcalase处理更大程度提高了WNPI水解物的溶解度，这可能与水解度有关：水解度越高，更多的可溶性多肽通过水解释放出来，溶解性改善越明显。Yust等采用固定化碱性蛋白酶水解鹰嘴豆蛋白，同样发现水解度与蛋白质的溶解度紧密相关。
图7-37 经Alcalase和Trypsin处理后WNPI的溶解度
3.乳化性及乳化稳定性
WNPI经过Alcalase和Trypsin水解后，其水解物的乳化性及乳化稳定性如图7-38所示，从图7-38可以看出，Trypsin作用下，WNPI的乳化性及乳化稳定性随水解时间的增加逐渐升高；在Alcalase水解过程中，WNPI的乳化性及乳化稳定性随水解时间延长反而逐渐降低，且经相同时间处理后Trypsin水解物的乳化性及乳化稳定性明显高于Alcalase水解物。乳化性是蛋白质形成乳液的能力，乳化稳定性是指乳液保持分散而不分层、絮凝、凝聚的能力。WNP I经酶处理水解成为分子质量更小、结构更松散的产物，部分疏水结构暴露于蛋白质表面，进而有利于酶解产物在油水界面展开，形成黏弹性的膜，减小界面张力；同时，经水解后蛋白质的溶解性得到改善，有更多的蛋白质吸附在油水界面，这些因素都有利于提高蛋白质的乳化性和乳化稳定性。但是水解度过高，会形成更小分子质量的多肽，导致WNP I水解物的疏水性和亲水性残基失衡，降低WNP I的两亲性，不利于形成稳定乳液。有相关研究发现，适度水解谷蛋白、大麻蛋白能够提高蛋白质的乳化性和乳化稳定性，过度水解反而不利于乳液的形成和稳定。
图7-38 经Alcalase和Trypsin处理后WNPI的乳化性和乳化稳定性
4.ζ电位
ζ电位可以提供界面处净表面电荷和潜在电荷分布。蛋白质是一种包含许多氨基酸残基的聚合物，所以它们可以携带正电荷或负电荷。WNP I在Alcalase和Trypsin作用下水解30，60，90min ζ电位如图7-39所示，从图7-39可以看出，经Trypsin水解后WNPI ζ电位升高（-23.5～-21.35mV），Alcalase水解后WNPI ζ电位降低（-28.00～-23.5mV），二者之间有明显的差别。WNPI pI 5.0左右，pH 8.0，蛋白质带负电，故ζ电位为负值。Alcalase和Trypsin酶切位点不同，暴露于溶剂的氨基酸残基极性不同，导致两种蛋白酶产生的水解物ζ电位存在差异。Yust等发现随着水解度的增加，鹰嘴豆蛋白水解物的电位降低。
5.SDS-PAGE
图7-40为Alcalase和Trypsin酶解处理WNPI水解物的还原电泳图，WNPI的电泳图呈现出5个主要的条带，分子质量分别是44.1～62.0ku（a），35.2～39.4ku（b），21.0～27.9ku（c），～14.4ku（d），8.6～9.8ku（e）。从图7-40可以看出，在Trypsin作用下，b最先消失，可能是这部分Lys、Arg含量较高，最易水解，c、d、e条带颜色加深，出现新条带约29.6ku（f）和约12.1ku（g），反应时间超过30min后a逐渐消失，水解继续进行，c颜色变浅。在Alcalase的作用下，WNPI的水解程度较高，反应30，60，90min后产生的条带几乎相同，从L5、L6、L7可以看出，a、b条带完全消失，c、d条带部分水解，出现新条带～16.6ku（h）。综述分析，Alcalase和Trypsin的酶解作用促使WNPI结构发生明显变化，酶解作用促使蛋白质聚集体的肽键断裂，产生小分子蛋白质亚基和多肽，导致蛋白质三、四级结构发生改变。
图7-39 经Alcalase和Trypsin处理后WNPI的ζ电位
图7-40 Alcalase和Trypsin酶解后WNPI的还原电泳图谱
1：未处理；2～4：Trypsin处理（30，60，90min）；5～7：Alcalase处理（30，60，90min）
6.游离巯基含量
WNPI在Alcalase和Trypsin酶解处理后游离巯基含量如图7-41所示，从图7-41可以看出，经Alcalase和Trypsin水解后，WNPI游离巯基含量显著升高，酶解时间延长可进一步提升游离巯基含量，在相同处理时间下，Trypsin酶解物游离巯基含量高于Alcalase酶解物。这归因于蛋白水解促进蛋白质/多肽部分结构展开，导致部分巯基暴露于分子表面，同时，二硫键断裂，重新形成巯基，随着水解进一步进行，蛋白质变成小相对分子质量的多肽，更多的基团从分子内部暴露出来，巯基的含量增加。两种酶水解物巯基含量的差异可能是两种酶活性位点不同，水解方式不同所致。
图7-41 经Alcalase和Trypsin处理后WNPI的游离巯基含量
7.荧光光谱
WNPI在Alcalase和Trypsin作用下水解30，60，90min荧光光谱图如图7-42所示，从图7-42可以看出，Trypsin水解产物的荧光强度增强，最大荧光发射波长红移约3nm，Alcalase水解产物荧光强度减弱，最大荧光发射波长红移8～10nm。内源荧光光谱检测的蛋白质三级结构的变化与Phe、Tyr、Trp残基有关，Alcalase是肽链内切酶，催化作用位点主要作用于含疏水性羰基如Phe、Tyr、Trp肽键，WNP I经水解产生多肽和小分子蛋白，内部疏水结构破坏，芳香族氨基酸残基暴露到溶剂中，在溶剂环境中Phe、Tyr、Trp残基发生荧光猝灭，导致荧光强度减弱。WNPI在Trypsin酶解作用下水解度较小，最大荧光发射波长红移不明显，Trypsin仅催化作用于Lys和Arg，而具有荧光特性的Phe、Tyr、Trp残基较少暴露于溶剂环境中，导致荧光强度增加。与Trypsin相比，WNPI经Alcalase处理水解度较大，致使较多疏水性氨基酸暴露于蛋白质表面，蛋白质结构有较大改变，因此，波长红移范围较宽。
图7-42 经Alcalase和Trypsin处理后WNPI的内源荧光强度
8.圆二色谱（CD）
WNPI在Alcalase和Trypsin作用下酶解后水解产物的圆二色谱图如图7-43所示，从图7-43可以看出，Alcalase和Trypsin的酶解产物在负峰的强度减弱，且负峰有蓝移趋势（峰值波长变小）。Alcalase和Trypsin酶解产物的二级结构分析见表7-10，WNPI经Trypsin处理后，水解度从2.70%增加到3.97%，α—螺旋、β—转角含量显著减少（p＜0.05），β—折叠、无序结构显著增加（p＜0.05），WNPI经Trypsin水解30min后α—螺旋和β—转角分别减少至20.7%、19.3%；经Alcalase处理后，水解度从7.94%增加到13.25%，二级结构变化与Trypsin处理的结果差异不大，α—螺旋、β—转角、β—折叠和无序结构含量均在20%、19%、24%、38%左右。以上结果显示，水解度达到2.7%左右时，蛋白质的二级结构已经发生明显变化，随着酶解反应进行，肽键不断断裂；然而水解度进一步增加，蛋白质的二级结构并没有发生明显改变。WNP I 经酶解处理，无序结构增加，稳定性降低，对其功能特性产生影响。Xu等在对胰蛋白酶处理的大米谷蛋白水解物研究中发现，随着水解度的增加，蛋白质的α—螺旋、无序结构增加，β—折叠、β—转角含量减少，与本研究结果有一定差异，这可能是由于蛋白原料以及采用蛋白酶不同所致。
图7-43 Alcalase和Trypsin酶解WNPI的圆二色谱图
表7-10 Alcalase和Trypsin酶解处理对WNPI二级结构的影响
9.扫描电镜（SEM）分析
WNPI经Alcalase和Trypsin水解30，60，90min后的1000×SEM图如图7-44所示，从图7-44可以看出，未处理的WNPI为完整的大片状结构，Trypsin水解产物的片状结构依然比较完整，但是片状结构表面出现蜂窝状的空穴，这是Trypsin与WNPI催化位点结合发生催化作用所致，比较水解30，60，90min的酶解产物，蛋白质的片状结构大小差异不明显。与之相反，Alcalase的酶解产物结构发生了明显的变化，大的片状结构遭到破坏，较小的碎片聚集在一起，且随着水解程度的加深，碎片越来越多。可见，不同蛋白酶对蛋白质形貌影响较大。
图7-44 经Alcalase和Trypsin处理后WNPI的微观结构变化
（四）小结
对比研究了WNPI经Trypsin、Alcalase酶解改性产物的功能特性和结构变化，采用荧光光谱、圆二色谱研究酶解物二、三级结构变化，SDS-PAGE 图分析蛋白质分子质量改变，SEM 观察微观结构差异，ζ电位仪测定蛋白质表面电位的变化，并研究了水解前后WNP I溶解性、乳化性、乳化稳定性以及游离巯基含量的差异，得出以下结论。
（1）Alcalase对WNPI的水解能力高于Trypsin。
（2）水解产物溶解度明显提高，且Alcalase酶解物溶解度高于Trypsin酶解物。
（3）适度水解能提高乳化性和乳化稳定性，Trypsin酶解产物乳化性和乳化稳定性随水解度增加而提升，Alcalase酶解产物乳化性和乳化稳定性变化趋势与之相反。
（4）Trypsin酶解物 ζ 电位随水解度增加而增大；Alcalase酶解产物 ζ 电位随水解度增加反而减小。
（5）WNPI经酶水解后游离巯基含量增加。
（6）Trypsin酶解产物最大荧光发射波长都有红移现象；与WNPI相比，Al-calase酶解产物内源荧光强度减弱，而Trypsin酶解产物内源荧光强度增强。
（7）酶解处理显著增加WNPI的无序结构，减少有序结构含量，两种酶处理的产物的α—螺旋、β—折叠、β—转角、无序结构含量没有明显差异。
（8）由蛋白质水解生产的小分子聚集体和多肽随水解程度提高而提升。
（9）Trypsin酶解物可保留比较完整的片状结构，Alcalase酶解物则有许多小的聚集体出现。
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