一、水酶法制取核桃油及核桃蛋白工艺流程
核桃水酶法制油及制蛋白工艺流程如下。
步骤一：
步骤二：
步骤三：
二、水酶法制取核桃油工艺操作要点
（1）核桃仁脱皮 去壳后的核桃仁，以4% Na2CO3和10% Ca（OH）2混合液100℃热烫20min去掉外包种皮，然后用清水洗净，沥水晾干。
（2）烘烤90℃烘烤15min。
（3）磨浆 在50℃温水下浸泡1h，料液比1∶5（g/mL），匀浆机中匀浆20～25min。
（4）灭酶 浆液加热至100℃灭酶5min，降温至50℃。
（5）酶解 采用淀粉酶和蛋白酶复合酶，酶用量为2.0%，酶解pH 6.0，50℃的条件下酶解2h。
（6）离心分离 酶解完成后，8000r/min离心30min，分离核桃油。
（7）破乳 向乳油中加入破乳剂，调节pH为4.5，用强烈的机械搅拌机进行破乳，温度调节为80℃，且在酸性条件下，可促使乳化液由水包油型（O/W）向油包水型（W/O）转化而实现破乳。
核桃仁的粉碎方法可分两种：机械干磨法及湿磨法。干磨法通常用于含油量较低的物料，粉碎时可避免油脂乳化。由于核桃仁是高油分物料，在干磨过程中易结成油饼或形成糊状，阻碍进一步碾磨，而湿磨法在研磨时加入了大量的水，会加重油水乳化现象。故在生产及科研试验中，可考虑利用干磨与湿磨各自的优点，结合利用。
在水酶法提取油脂的预处理工艺中，原料破碎程度是影响酶作用及油得率的重要因素。颗粒越小，提油率越高。王瑛瑶认为，纵然湿法破碎的物料平均粒径小于干法粉碎，但湿法破碎后的乳状液要比干法破碎形成的乳状液稳定得多，更难于破乳，破乳后有1.421%的油脂残存于乳状液中，这可能与原料的结构组成不同有关。通常使用干法与湿法相结合的方法，既可避免形成稳定性高的乳状液，同时可将原料充分破碎。
李天兰等人的研究认为，提取核桃油预处理的最佳工艺为：热处理时间19min、热处理温度53℃、磨浆时间8min。在此最佳预处理条件下核桃油的提取率为54.83%。酶解工艺的最佳试验组合为：酶解温度60℃、酶添加量3.5%（即纤维素酶70U/g原料，木瓜蛋白酶3360U/g原料）、料液比1∶8、酶解时间4.0h，清油提取率为76%。易建华等人讨论了酶的选择对核桃油提取率的影响，认为三种酶，即蛋白酶、果胶酶与纤维素酶的复配效果最佳，清油提取率在40%以上。
在水酶法提取核桃油的过程中，酶作用底物一段时间后，蛋白质、油脂等大分子物质从细胞内扩散到水相中，而蛋白质具有双亲性，表面活性显著，一部分链段具疏水性，一部分则是亲水性的。界面上存在的具双亲基团蛋白质大分子吸附层可通过本身的结构产生斥力，来克服因布朗运动或其他外在因素导致的液滴相互靠近，为乳状液提供良好的空间稳定性。因此必须对酶解液进行破乳操作。破乳工艺在水酶法提取核桃油中是重要的一个环节，溶液在酶解过程中会形成较稳定的乳状液，使得油脂很难游离出来，因此破乳工艺在很大程度上关系到提油率的高低。李天兰等人的研究认为，破乳工艺对核桃油提取率影响的最佳工艺参数为离心转速12000r/min，离心时间25min，pH为4.5。在此条件下的提取率为84.01%。
三、水酶法提取核桃油及蛋白的研究
近年来的研究表明，用酶处理可提高油脂得率，而温和的酶处理条件对脱脂后油料饼的进一步利用有较大好处，但因有效酶制剂（主要是纤维素酶、果胶酶等）成本长期高居不下而影响了该法的应用，针对这些不足，以核桃饼为原料，采用产量大、价格低廉的碱性蛋白酶作提油用酶，可在温和的处理条件下探索出一条可行的提油工艺路线。
（一）核桃油提取率以及蛋白质的提取率和纯度的计算公式
核桃油提取率（%）=提取核桃油的质量/（样品质量×核桃饼中油脂质量分数）×100
核桃蛋白提取率（%）=制备得到的蛋白质量/原料中蛋白质量×100
核桃蛋白纯度（%）=蛋白质量/分离蛋白干基质量×100
（二）单因素试验
1.酶解温度的影响
取20g样品，加双蒸水混合，料液比1∶10，在反应温度为40，45，50，55℃的条件下，调pH为9，加酶量为0.2%，酶解3h后，90℃下灭酶10min，冷却，5000r/min离心30min，取油层，测量油脂得率，同时对蛋白质量及纯度进行检测，计算蛋白得率。
2.酶解pH的影响
取20g样品，加双蒸水混合，料液比1∶10，调反应温度为50℃，在反应pH为8，9，10，11的条件下，加酶量为0.2%，酶解3h后，90℃下灭酶10min，冷却，5000r/min离心30min，取油层，测量油脂得率，同时对蛋白质量及纯度进行检测，计算蛋白得率。
3.酶解时间的影响
取20g样品，加双蒸水混合，料液比1∶10，反应温度为50℃，pH为9的条件下，加酶量为0.2%，酶解时间为2，3，4，5h后，90℃下灭酶10min，冷却，5000r/min离心30min，取油层，测量油脂得率，同时对蛋白质量及纯度进行检测，计算蛋白质得率。
4.加酶量的影响
取20g样品，加双蒸水混合，料液比1∶10，反应温度为50℃，pH为9的条件下，加酶量为0.1%、0.2%、0.3%、0.4%，酶解3h后，90℃下灭酶10min，冷却，5000r/min离心30min，取油层，测量油脂得率，同时对蛋白质量及纯度进行检测，计算蛋白得率。
（三）酶解工艺的正交试验
在单因素实验的基础上，考虑各因素的交互作用。选择反应pH、反应温度、加酶量和酶解时间进行正交试验。
（四）糖化酶酶法去杂提高产品蛋白质纯度
用上述方法制备得到的蛋白作为原料，加双蒸水混合均匀，根据糖化酶的适合反应条件，调节pH 4～5，温度55℃下加入0.2%的酶水解60min，90℃下灭酶10min，冷却，5000r/min离心30min，取沉淀水洗调pH 7，冷冻干燥后保存。
（五）不同水解酶对油脂及蛋白质得率的影响
采用酶解工艺可以有效瓦解细胞壁，促使细胞内物质溶出。采用能降解植物油料细胞壁的酶或对脂蛋白脂多糖等复合体有降解作用的酶（主要包括纤维素酶、果胶酶、淀粉酶、蛋白酶等）处理油料可以提高油脂提取效果。不同酶制剂对油脂及蛋白质得率的影响如图5-1所示。
由图5-1可知，对于核桃来说，碱性蛋白酶是最适合其油脂及蛋白的水酶法提取的酶制剂。(www.xing528.com)
（六）酶解工艺条件的确定
1.酶解温度的影响
温度对核桃饼油脂得率及蛋白质得率的影响如图5-2所示。
图5-1 不同酶制剂对油脂及蛋白质得率的影响
图5-2 温度对核桃饼油脂得率及蛋白质得率的影响
当温度在40～50℃时，出油率随着温度的上升迅速提高，当温度高于50℃后，出油率下降。这是由于当温度在40～50℃时，随着温度的升高逐渐接近酶的最适温度，酶的作用增强，所以出油率提高。当温度超过50℃时，酶的活力有所下降，同时核桃蛋白的溶解度较大，分子的立体结构伸展，其对油滴的吸附能力增大，故出油率减小。而对于蛋白在此研究条件下，随着温度的升高蛋白得率也缓慢升高，故酶解温度在50℃左右较为合适。
2.酶解pH的影响
考虑到碱性蛋白酶的活性，酶解pH选取8，9，10和11。反应pH对核桃饼油脂得率及蛋白质得率的影响如图5-3所示。
当体系pH由8增加到9时候，提油率升高并达到峰值75.65%。当pH超过9时提油率开始下降。体系pH与蛋白质溶解度有关，而蛋白质的溶解又与油脂释放密切相关。随着pH的增加，一方面核桃蛋白水解程度增大，包裹在核桃蛋白内或与核桃蛋白以氢键相连的油脂释放得越多，另一方面，pH影响了核桃蛋白分子、油脂分子及酶蛋白分子的性质，使碱性蛋白酶在新的水油混合体系中和底物的契合达到了新的平衡，促进了酶解的进行；但蛋白质溶解度较大时，会增加乳化程度，反而使提油率下降，故当体系pH在8～10的范围内蛋白得率是逐渐升高并且达到最高值。综合结果来看，反应pH取9最合适。
图5-3 反应pH对核桃饼油脂得率及蛋白质得率的影响
3.酶解时间的影响
反应时间对核桃饼油脂得率及蛋白质得率的影响如图5-4所示。
图5-4 反应时间对核桃饼油脂得率及蛋白质得率的影响
由图5-4可以看出，酶作用4h时提油率最高，在4h以后，提油率开始下降。这是因为随着酶解时间的增加，细胞壁逐渐降解，酶与底物反应越彻底，油的释放也会相应增加。但提油时间过长，会导致油品质的下降。由于核桃油不饱和脂肪酸含量很高，极易被氧化，所以酶解时间不宜过长。蛋白随着酶解时间的增加得率保持增加趋势，可能是酶解过程的持续进行使得蛋白质更多地从细胞中释出，而由于蛋白的释出，蛋白促进了乳化层的形成，因此使得油脂存于乳化层中，使得油脂得率下降。但是3h以后两者得率的增长都比较缓慢，所以反应时间为3h最为适宜。
4.加酶量的影响
加酶量对核桃饼油脂得率及蛋白质得率的影响如图5-5所示。
图5-5 加酶量对核桃饼油脂得率及蛋白质得率的影响
蛋白酶能够破坏细胞壁结构，使得里面的物质释放出来，从而能有效提高油和蛋白的得率。随着酶用量的增加，油脂得率先增加后降低，当添加量达到0.3%时，油脂得率为81.45%。对于蛋白提取，在此实验蛋白质得率随着加酶量的增加而升高，蛋白质得率逐渐上升，后半段升高趋势缓慢。由此可得，在考虑经济因素的情况下，加酶量为0.3%时，油脂及蛋白质得率均达到较高值。
5.酶解工艺的正交实验
各因素对提油率影响的主次顺序为酶添加量＞酶解时间＞酶解温度＞酶解pH，最优组合为酶解pH为9，酶解时间为4h，加酶量为0.4%，酶解温度为50℃。
直观分析趋势图如图5-6所示。
为验证优化工艺条件的可靠性和重现性，对最优工艺条件进行3次重复实验，测得的3次验证试验核桃饼提油率达85.02%。
6.蛋白纯化工艺的确定
（1）酶法去杂 加入糖化酶后，蛋白的纯度由75.34%提高到81.26%。
（2）蛋白水洗次数和温度的最佳条件确定 水洗温度对蛋白纯度的影响如图5-7所示。
水洗次数对蛋白纯度的影响如图5-8所示。
图5-6 直观分析趋势图
图5-7 水洗温度对蛋白纯度的影响
图5-8 水洗次数对蛋白纯度的影响
由图5-7可知，水洗温度为40℃时蛋白纯度达到最高为85.68%；由图5-8可以知道，随着水洗次数的增加，水洗纯度越高，前期增长较快，后期增加缓慢，然而水洗次数越多，蛋白的得率会下降，蛋白损失多，所以选择水洗两次最好。
（七）结论
（1）先通过单因素实验分析各因素的影响趋势，再考虑其各因素的交互作用设计四因素三水平的正交实验，以对提油率为主要指标，得到影响提油率的主次顺序为酶添加量＞酶解时间＞酶解温度＞酶解pH，最优组合为酶解pH为9，酶解时间为4h，加酶量为0.4%，酶解温度为50℃。最后通过验证优化工艺条件的可靠性和重现性，得到核桃饼提油率达85.02%。
（2）对水酶法提得的粗蛋白进行加酶去杂纯化，根据糖化酶的适合反应条件，调节pH 4～5，温度55℃下加入0.2%的酶水解60min，水洗温度为40℃时水洗蛋白两次得到纯度为85.98%的核桃粗蛋白。
四、水酶法提取核桃油及蛋白的工艺设备
用于核桃水酶法制油，处理量4t/d的设备一览表见表5-1。
表5-1 处理量4t/d的设备一览表
续表
尽管水酶法提取油脂的工艺还未在实际生产中普及，但随着石油资源的匮乏、企业对降低生产成本的渴望以及人们对油脂质量要求的提高，水酶法会在未来油脂制取中得到发展，同时借助高效提取、分离技术回收蛋白质、多糖等有用成分，可实现科学、全面、客观地体现水酶法的优势，加速推进该技术的普及和工业化的进程。
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