差异表达基因GO功能注释及显著性富集分析

7.2.4.1　愈伤组织与胚性愈伤组织差异表达基因GO功能注释及显著性富集分析

对各样品的表达基因与差异表达基因进行了GO功能注释与GO功能显著性富集分析。愈伤组织（Callus）与胚性愈伤组织（PIC_15_EC）间测序基因数量与差异表达基因存在较大的差异[见图7-8，图7-11（a）]，愈伤组织测序统计结果共产生41 861个基因序列，而胚性愈伤组织（PIC_15_EC）测序共产生52 971个基因序列，二者在基因表达量上存在11 110（26.5%）的差异[见图7-11（a）]。以上结果表明愈伤组织发育到胚性愈伤组织有大量的基因参与调控此过程，且这些基因在获得GO功能注释后发现它们广泛地参与到分子功能（molecular function）、细胞组分（cellular component）及生物学过程（biological process）方面的调控[见图7-11（a）]。愈伤组织与胚性愈伤组织间差异表达基因的GO功能注释结果表明差异表达基因在细胞组分（cellular component）的细胞（cell）、细胞部分（cell part）与细胞器（organelle）、分子功能（molecular function）的结合功能（banding activity）与催化功能（catalytic activity）及生物学过程（biological process）中的细胞过程（cellular process）与代谢过程（metabolic process）中占有最大的比例[见图7-11（b）]。在两个样品中，差异表达基因总数为9 485，其中上调表达基因数量为7 342，下调表达为2 143。对上调基因与下调基因进行GO功能显著性富集分析发现在大部分的功能目录（term）中都具有显著性（p＜0.05）[见图7-11（c）]。

图7-11　百子莲愈伤组织与胚性愈伤组织测序基因GO功能分类

（a）愈伤组织与胚性愈伤组织所有表达基因GO功能分类　（b）愈伤组织与胚性愈伤组织差异表达基因GO功能分类　（c）愈伤组织与胚性愈伤组织上调与下调表达基因GO功能分类（∗P＜0.05）

图7-12　百子莲愈伤组织与胚性愈伤组织上调表达基因GO生物学过程显著性富集可视化分析

由于愈伤组织与胚性愈伤组织间差异表达基因数量较多，因此在生物学过程（biological process）、细胞组分（cellular component）及分子功能（molecular function）的GO功能显著性富集可视化分析方面把差异基因分为上调表达基因与下调表达基因2组分别进行GO显著性富集分析。在生物学过程（biological process）GO功能显著性富集可视化分析中，上调表达基因GO功能主要富集在刺激响应（respone to stimulus）、生物调控（biological regulation）、生长（growth）、多细胞组织过程（multicellular organismal process）、发育过程（developmental process）、代谢过程（metabolic process）、生殖（reproduction）和细胞元件组织（cellular component organization）（见图7-12）。在刺激响应（respone to stimulus）中富集程度最高的条目是内源刺激响应（respone to endogenous stimulus，p＝4.2e-07）；生物调控（biological regulation）下级目录中主要包括细胞生长（cell growth，p＝6.99e-08）和细胞分化（cell differentiation，p＝5.63e-14）；代谢过程（metabolic process）的下级目录涵盖基因表达调控（regulation of gene expression，p＝1.3e-14）、翻译（translation，p＝4.62e-06）、转录（transcription，p＝1.14e-11）和蛋白修饰（protein modification，p＝0.043 3）；发育过程（developmental process）的下级目录内容主要为胚胎发育（embryonic development，p＝1.97e-14）、胚后期发育（post-embryonic development，p＝2.38e-33）、解剖结构形态（anatomical structure morphogenesis，p＝1.05e-17）与生殖结构形态（reproductive structure morphogenesis，p＝3.34e-28）。

在百子莲愈伤组织与胚性愈伤组织生物学过程（biological process）GO功能显著性富集可视化分析中，下调表达基因GO功能主要富集在刺激响应（respone to stimulus）、细胞过程（cellular process）、代谢过程（metabolic process）与多机体过程（multi-organism process）（见图7-13）。这些条目的下级目录主要包括在生物刺激响应（response to biotic stimulus，p＝4.33e-08）、代谢产物前体（generation of precursor metabolites，p＝1.32e-08）、次生代谢（secondary metabolic process，p＝8.48e-09）与糖代谢过程（carbohydrate metabolic process，p＝3.86e-08）。

细胞组分（cellular component）显著性富集分析中，上调表达基因GO功能主要富集于膜封闭腔（membrane-enclosed lumen）、大分子复合体（macromolecular complex）、细胞器（organelle）与细胞部分（cell part）（见图7-14，图7-15）。下级GO功能目录主要富集在细胞骨架蛋白（cytoskeleton，p＝7.21e-08）、细胞核（nucleolus，p＝5.11e-16）、核质（nucleoplasm，p＝0.003 5），核膜（nuclear envelopep）、细胞壁（cell wall，p＝0.026 1）与细胞溶胶（cytosol，p＝6.04e-12）。

上调表达基因的细胞组分（cellular component）显著性富集分析中，其2级功能条目主要包括细胞（cell），细胞器（organelle）与胞外区（extracellular region）。富集程度较高的下级GO功能条目包括胞内膜（envelope）、细胞器内膜（organelle envelope）、质体（plastid）、液泡（vacuole）、细胞壁（cell wall）、类囊体（thylakoid）与过氧化物酶体（peroxisome）。

图7-13　百子莲愈伤组织与胚性愈伤组织下调表达基因GO生物学过程显著性富集可视化分析

图7-14　百子莲愈伤组织与胚性愈伤组织上调表达基因GO细胞组分显著性富集可视化分析

分子功能（molecular function）显著性富集分析中，下调表达基因注释上的GO功能较少，包括催化活性（catalytic activity）和转运活性分子（transporter activity）。上调表达基因注释上的GO功能较多，包含催化活性（catalytic activity）、转录调控活性（transcription regulator activity）、结合分子（binding）与结构分子（structural molecule activity）（见图7-16）。这些GO功能单元的下级功能条目主要包括：具有水解活性的核苷-3-磷酸酶活性分子（nucleoside-triphosphatase activity，p＝1.21e-16）、转录因子（transcription factor，p＝8.8e-24）、RNA结合分子（RNA binding，p＝0.002 98）与受体蛋白结合分子（protein receptor binding，p＝1.85e-14）。

图7-15　百子莲愈伤组织与胚性愈伤组织下调表达基因GO细胞组分显著性富集可视化分析

7.2.4.2　不同浓度PIC继代的胚性愈伤组织间差异表达基因GO功能注释及显著性富集分析

不同浓度PIC（1.0，1.5，2.0 mg/L）继代的百子莲胚性愈伤组织测序获得的序列的GO功能注释结果表明3者的表达基因在细胞（cell）、细胞部分（cell part）、细胞器（organelle）结合分子（binding）催化活性（catalytic activity）细胞过程（cellualr process）与代谢过程（metabolic process）中占有最大的比例；而在细胞（cell）、细胞部分（cell part）与细胞器（organelle）三者存在显著性差异（P＜0.05）[见图7-17（a）]。1.0 mg/L，2.0 mg/L PIC与1.5 mg/L PIC继代的EC间差异表达基因GO功能注释结果中所占比例最高的功能注释条目与表达序列的结果相似，但是只有在共质体（symplast）中它们存在差异表达的显著差异[见图7-17（b）]。

图7-16　百子莲愈伤组织与胚性愈伤组织差异表达基因GO分子功能显著性富集可视化分析

（a）上调表达基因的GO分子功能显著性富集分析　（b）下调表达基因的GO分子功能显著性富集分析

图7-17　不同浓度PIC继代的百子莲胚性愈伤组织间测序基因GO功能分类

（a）不同浓度PIC继代的胚性愈伤组织所有表达基因GO功能分类　（b）不同浓度PIC继代的胚性愈伤组织间差异表达基因GO功能分类　（c）1.0与1.5 mg/L PIC继代的胚性愈伤组织上调与下调表达基因GO功能分类　（d）2.0与1.5 mg/L PIC继代的胚性愈伤组织上调与下调表达基因GO功能分类（∗P＜0.05）(www.xing528.com)

与1.5 mg/L PIC继代的百子莲EC相比，1.0 mg/L PIC继代的百子莲EC中上调表达与下调表达的基因数量分别为742与691，差别不大。但是在GO功能注释结果中，上调表达与下调表达的基因在较多的功能条目中存在显著性差异[见图7-17（c）]；包括cell，cell part，macromolecular complex，membrane-enclosed lumen，organelle，organelle part，symplast，binding，catalytic activity，structural molecule，transporter，anatomical structure formation，biological regulation，cellular component biogenesis，cellular component organization，cellular process，developmental process，establishment of localization，localization，growth，multicellular organismal process，pigmentation，reproduction与reproductive process。2.0 mg/L PIC与1.5 mg/L PIC继代的百子莲EC相比，上调表达与下调表达的基因数量分别为786与824，在较多的功能条目中也存在显著性差异[见图7-17（d）]；但与图7-17（c）所示相比，两图之间的具有显著性差异的功能类别还是略有不同，这些具有差异的功能条目类别包括：cell（1.0），cell part（1.0），extracellular region（2.0），symplast（1.0），antioxidant（2.0），structural molecule（1.0）[见图7-17（c）（d）]。

相比于1.5 mg/L PIC继代的EC，1.0 mg/L PIC继代样品的上调表达基因在生物学过程的GO功能显著性富集主要表现在刺激响应（response to stimulus）、信号（signaling）、细胞（cellular process）、代谢过程（metabolic process）、定位（localization）与多机体过程（multi-organism process）（见图7-18）。刺激响应的下级功能目录包括内源刺激响应（response to endogenous stimulus，p＝6.63e-05）、（response to biotic stimulus，p＝0.003 08）、胞间刺激响应（response to extracellular stimulus，p＝1.04e-09）、细胞信号（cell communication，p＝1.88e-06）；代谢过程的下级功能目录集中在细胞氨基酸代谢过程（cellular amino acid and derivative metabolic process，p＝0.044）、糖代谢过程（carbohydrate metabolic process，p＝0.015 7）及次生代谢过程（secondary metabolic process，p＝0.028 9）；定位（localization）主要表现在分子运输（transport，p＝0.034 4）上。上述结果表明1.0 mg/L比1.5 mg/L PIC继代的EC具有更加旺盛的糖代谢、次生代谢、信号及分子运输过程。

图7-18　1.0与1.5 mg/L PIC继代的胚性愈伤组织间上调表达基因生物学过程GO功能显著性富集分析

相对于1.5 mg/L PIC继代的EC，1.0 mg/L PIC继代样品的下调表达基因在生物学过程的GO功能显著性富集主要表现在生物调控（biological regulation）、代谢过程（metablic process）、细胞过程（cellular process）、多细胞组织过程（multicellular organismal process）、发育过程（developmental process）、生殖（reproduction）、生长（growth）、细胞元件组织（cellular component organization）、刺激响应（response to stimulus）（见图7-19）。在2级GO功能目录下所对应的主要下级条目包括：调控基因表达与表观调控（regulation of gene expression，epigenetic；p＝0.000 491）、细胞大分子生物合成过程（cellular macromolecule biosynthetic process，p＝0.032 4）、DNA代谢过程（DNA metabolic process，p＝1.06e-14）、细胞周期（cell cycle，p＝6.32e-16）、细胞发育过程（cellular developmental process，p＝0.011 6）、解剖结构形态（anatomical structure morphogenesis，p＝2.72e-05）、胚胎发育（embryonic development，p＝0.040 4），胚后发育（post-embryonic development，p＝9.6e-06）、生殖结构发育（reproductive structure development，p＝2.73e-05）。以上分析结果说明1.5 mg/L比1.0 mg/L PIC继代的EC表现出更明显的细胞分裂、胚性结构建立及基因表达调控过程。

图7-19　1.0与1.5 mg/L PIC继代的胚性愈伤组织间下调表达基因生物学过程GO功能显著性富集分析

图7-20　1.0与1.5 mg/L PIC继代的胚性愈伤组织间上调表达基因细胞组分GO功能显著性富集分析

1.0 mg/L比1.5 mg/L PIC继代的EC上调表达的基因在细胞组分GO功能注释中主要参与了细胞部分（cell part）与胞外区（extracellular region），而它们各自的下级GO条目包括质膜（plasma membrane，p＝0.000 77），液泡（vacuole，p＝3.12e-08）和细胞壁（cell wall，p＝8.78e-06）（见图7-20）。在下调表达的基因的细胞组分GO功能注释中主要包含的2级GO条目有：细胞（cell）、大分子复合体（macromolecular complex）、细胞器（organelle）与胞外区（extracellular region）（见图7-21）。下调差异表达的基因在下级GO功能条目中主要体现在细胞壁（cell wall，p＝0.007 18）、质膜（plasma membrane，p＝0.008 15）、细胞骨架蛋白（cytoskeleton，p＝5.58e-07）与细胞核部分（nuclear part，p＝6.99e-05）。以上结果表明在细胞组分中1.0 mg/L与1.5 mg/L PIC继代的EC间差异主要与细胞壁、质膜、细胞骨架蛋白、液泡及细胞核有关。而这些元件又和细胞形态、特异性基因表达调控具有重要的联系。

图7-21　1.0与1.5 mg/L PIC继代的胚性愈伤组织间下调表达基因细胞组分GO功能显著性富集分析

1.0 mg/L相比1.5 mg/L PIC继代的EC差异表达基因分子功能方面的GO功能主要富集在催化活性（catalytic activity）、结合活性（binding）与转运活动（transporter activity）。其中下调表达基因的催化活性主要表现在核苷-3-磷酸酶活性（nucleoside-triphosphatase activity，p＝2.74e-07）；结合活性体现在蛋白结合（protein binding，p＝0.003 7）、核苷酸结合（nucleotide binding，p＝8.58e-08）、DNA结合（DNA binding，p＝2.61e-8）与染色质结合（chromatin binding，p＝5.12e-05）[见图7-22（a）]。上调表达基因富集的功能较少，主要包括转运活动（transporter activity，p＝0.017 3）、水解酶活性（hydrolase activity，p＝0.015 3）和糖结合活性（carbohydrate binding，p＝7.87e-07）[见图7-22（b）]。从GO功能富集结果中可以看出，1.0 mg/L相比1.5 mg/L PIC继代的EC其分子调控与结合活力下降，而糖基结合与修饰功能增强。

图7-22　1.0与1.5 mg/L PIC继代的胚性愈伤组织差异表达基因GO分子功能显著性富集分析

（a）下调表达基因的GO分子功能显著性富集分析　（b）上调表达基因的GO分子功能显著性富集分析

图7-23　2.0与1.5 mg/L PIC继代的胚性愈伤组织间上调表达基因生物学过程GO功能显著性富集分析

2.0 m g/L P I C比1.5 m g/L P I C继代的E C上调表达的基因中在生物学过程GO功能注释中2级目录下显著富集的条目只有刺激响应（resopnese to stumulus），其下级GO功能显著性富集的条目包括生长素刺激响应（response to auxin stimulus，p＝0.009 02）、脱落酸刺激响应（response to abscisic acid stimulus，p＝0.040 6）与钙离子响应（response to cadmium ion，p＝0.027 8）（见图7-23）。其他2级目录下包含的显著性富集的下级条目有：水转运（water transport，p＝0.006 49）、胺转运（amine transport，p＝0.037 4）、类黄酮生物合成（flavonoid synthetic process，p＝0.037 3）、细胞壁大分子催化过程（cell wall macromolecule catalytic process，p＝0.003 53）与氧化胁迫响应（responese to oxidative stress，p＝0.005 97）。以上注释结果说明外源PIC浓度偏高时，引起百子莲EC明显的生长素信号，脱落酸信号与钙信号响应；类黄酮属于次生代谢产物，具有抗氧化方面的生物活性，而脱落酸常参与细胞在胁迫环境下的信号调控；由于生长素信号、脱落酸信号、钙信号、类黄酮生物合成与氧化胁迫相关的功能基因同时上调表达，我们推断2.0 mg/L PIC继代的EC由于外源PIC浓度偏高可能对细胞产生了氧化胁迫伤害。

图7-24　2.0与1.5 mg/L PIC继代的胚性愈伤组织间下调表达基因生物学过程GO功能显著性富集分析

2.0 mg/L PIC比1.5 mg/L PIC继代的EC下调表达的基因中在生物学过程GO功能注释中生物调控（biological regulation）、生殖（reproduction）、多细胞生物学过程（multicellular organismal process）、细胞元件组织（cellular component organization）、生长（growth）和刺激响应（response to stimulus）表现出显著性GO功能富集（见图7-24）。各2级目录的下级条目主要集中在：DNA代谢过程（DNA metabolic process，p＝5.04e-07）、调控基因表达（regulation of gene expression，p＝0.019 2）、调控细胞过程（regulation of cellular process，p＝0.011 9）、细胞周期（cell cycle，p＝7.49e-08）、细胞分化（cell differentiation，p＝0.001 73）、生殖结构发育（reproductive structure development，p＝0.000 288）、解剖结构形态（anatomical structure morphogenesis，p＝0.000 388）、胚胎发育（embryonic development，p＝0.001 82）与胚后发育（post-embryonic development，p＝0.000 13）。以上功能分析表明2.0 mg/L PIC比1.5 mg/L PIC继代的EC在基因表达、细胞分裂、胚性保持方面均有下降的趋势。

在细胞组分GO功能富集中，上调表达基因功能上主要包括胞外区（extracellular region，p＝2.55e-11）、质膜（plasma membrane，p＝0.000 434）、细胞壁（cell wall，p＝0.000 478）与液泡（vacuole，p＝2.46e-06）（见图7-25）。而下调表达基因功能上有细胞核部分（nuclear part，p＝0.044 9）与胞内非膜结合细胞器（intracellular non-membrane-bounded organelle，p＝8.05e-05）（见图7-26）。

在分子功能GO功能富集中，下调表达基因没有显著性富集结果，上调表达基因的显著性富集结果主要集中于转录因子活性（transcription factor activity，p＝0.031 9）与水解酶活性（hydrolase activity，p＝0.031 9）（见图7-27）。